PCR שאלות נפוצות 1. שלילי כוזב, לא מופיעה פס הגברה 2. חיובי כוזב 3. מופיעות פסי הגברה לא ספציפיים 4. מופיעות רצועות גרירה מתקלפות או פסי מריחה:

1שלילי כוזב, לא מופיעה פס מוגבר ההיבטים העיקריים של תגובת PCR הם

① הכנת חומצת גרעין תבנית

② איכות וספציפיות של פריימר

③ איכות האנזים ו

④ תנאי מחזור PCR. כדי למצוא את הסיבות, יש לבצע ניתוח ומחקר גם בקישורים שלעיל.

תבנית:

① התבנית מכילה חלבוני טומאה

② התבנית מכילה מעכבי אנזים Taq

③ החלבונים בתבנית אינם מתעכלים ומוסרים, במיוחד ההיסטונים בכרומוזומים

④ יותר מדי אבד במהלך החילוץ וההכנה של התבנית, או שפנול נשאף

⑤ חומצת הגרעין התבנית אינה דנטורטית לחלוטין. כאשר איכות האנזימים והפריימרים טובה, אם לא מופיעות פסי הגברה, סביר להניח שמשהו לא בסדר בתהליך העיכול של הדגימה או בתהליך מיצוי חומצת הגרעין של התבנית. לכן יש להכין תמיסת עיכול יעילה ויציבה, ולתקן את ההליך ואין לשנות אותו כרצונו. . השבתת אנזים: יש צורך להחליף את האנזים החדש, או להשתמש בו-זמנית גם באנזימים ישנים וגם באנזימים חדשים כדי לנתח האם שליליים כוזבים נגרמים מאובדן או פעילות לא מספקת של האנזים. יש לציין שלפעמים האנזים Taq נשכח. פריימרים: איכות הפריימר, ריכוז הפריימר והאם הריכוזים של שני הפריימרים סימטריים הם סיבות נפוצות לכישלון PCR או פסי הגברה לא מספקים ודיפוזיה קלה. יש בעיות עם איכות סינתזת הפריימר בכמה אצוות. לאחד משני הפריימרים יש ריכוז גבוה והשני בעל ריכוז נמוך, מה שגורם להגברה א-סימטרית ביעילות נמוכה.

אמצעי הנגד הם:

① בחר יחידת סינתזת פריימר טובה.

② ריכוז הפריימרים צריך לא רק להסתכל על ערך ה-OD, אלא גם לשים לב לתמיסת ה-primer לאלקטרופורזה של ג'ל agarose. חייבות להיות פסי פריימר, והבהירות של שתי פסי הפריימר צריכה להיות בערך זהה. לדוגמה, לפריימר אחד יש פס ולפריימר השני אין פס. עבור רצועות, PCR עלול להיכשל בשלב זה ויש לפתור אותו באמצעות משא ומתן עם יחידת סינתזת הפריימר. אם לפריימר אחד יש בהירות גבוהה ולשני בהירות נמוכה, איזון הריכוזים בעת דילול הפריימרים.

③ יש לאחסן פריימרים בריכוז גבוה ובכמויות קטנות כדי למנוע הקפאה והפשרה חוזרת או אחסון ממושך במקרר, מה שעלול להוביל להידרדרות ולפירוק של הפריימרים.

④עיצוב הפריימר אינו סביר, כגון אורך הפריימר אינו מספיק, נוצרים דימרים בין פריימרים וכו'. ריכוז Mg2+: לריכוז יונים Mg2+ יש השפעה רבה על יעילות הגברה של PCR. אם הריכוז גבוה מדי, זה יכול להפחית את הספציפיות של הגברה של PCR. אם הריכוז נמוך מדי, זה ישפיע על תפוקת הגברה של ה-PCR ואף יגרום לכשל בהגברת ה-PCR ללא פסי הגברה. שינויים בנפח התגובה: בדרך כלל הנפחים המשמשים להגברת PCR הם 20ul, 30ul ו-50ul. או 100ul, איזה נפח יש להשתמש להגברת PCR נקבע בהתאם למטרות שונות של מחקר מדעי ובדיקות קליניות. לאחר ביצוע נפח קטן, כגון 20ul, ולאחר מכן ביצוע נפח גדול יותר, אתה חייב לעקוב אחר התנאים, אחרת זה ייכשל בקלות. סיבות פיזיות: דנטורציה חשובה מאוד להגברת PCR. אם טמפרטורת הדנטורציה נמוכה וזמן הדנטורציה קצר, סביר מאוד להתרחש שלילי שווא; טמפרטורת החישול נמוכה מדי, מה שעלול לגרום להגברה לא ספציפית ולהפחית את יעילות ההגברה הספציפית. טמפרטורת החישול גבוהה מדי. משפיע מאוד על הקישור של פריימרים לתבניות ומפחית את יעילות הגברה של PCR. לפעמים יש צורך להשתמש במדחום רגיל כדי לבדוק את טמפרטורות הדנטורציה, החישול והארכה במגבר או בסיר המסיס במים. זו גם אחת הסיבות לכישלון PCR. וריאציה של רצף המטרה: אם רצף המטרה משתנה או נמחק, מה שמשפיע על הקישור הספציפי של הפריימר לתבנית, או שהפריימר והתבנית מאבדים את הרצף המשלים עקב מחיקת קטע מסוים של רצף המטרה, הגברה של PCR לא יצליח.

2.false positive רצועת ההגברה של PCR המופיעה תואמת את רצועת רצף המטרה, ולפעמים הרצועה מסודרת ומוארת יותר. עיצוב פריימר לא הולם: לרצף ההגברה שנבחר יש הומולוגיה עם רצף ההגברה הלא-מטרה, כך שכאשר מבצעים הגברה של PCR, תוצר ה-PCR המוגבר הוא רצף שאינו יעד. אם רצף המטרה קצר מדי או הפריימר קצר מדי, עלולות להופיע בקלות תוצאות חיוביות שגויות. יש לעצב מחדש את הפריימרים. זיהום צולב של רצפי מטרה או תוצרי הגברה: ישנן שתי סיבות לזיהום זה: ראשית, זיהום צולב של הגנום כולו או של שברים גדולים, המוביל לתוצאות חיוביות שגויות. ניתן לפתור חיובי כוזב זה בשיטות הבאות: היזהר ועדין בעת ​​ההפעלה כדי למנוע מרצף היעד להישאב לתוך אקדח הדגימה או להתיז החוצה מצינור הצנטריפוגה. למעט אנזימים וחומרים שאינם יכולים לעמוד בטמפרטורות גבוהות, יש לעקר את כל הריאגנטים או הציוד בלחץ גבוה. יש להשתמש בכל צינורות הצנטריפוגה וקצות פיפטה להזרקת דגימה פעם אחת. במידת הצורך, צינורות התגובה והריאגנטים מוקרנים באור אולטרה סגול לפני הוספת הדגימה כדי להשמיד את חומצות הגרעין הקיימות. השני הוא זיהום של שברים קטנים של חומצות גרעין באוויר. הפרגמנטים הקטנים הללו קצרים יותר מרצף המטרה, אך יש להם הומולוגיה מסוימת. ניתן לחבר אותם זה לזה, ולאחר שהם משלימים לפריימרים, ניתן להגביר את תוצרי ה-PCR, וכתוצאה מכך תוצאות חיוביות שגויות, אותן ניתן להפחית או להעלים בשיטות PCR מקוננות.

 

3. להקות הגברה לא ספציפיות מופיעות הרצועות המופיעות לאחר הגברה של PCR אינן עולות בקנה אחד עם הגודל הצפוי, גדול יותר או קטן יותר, או שגם פסי הגברה ספציפיים וגם פסי הגברה לא ספציפיים מופיעים בו-זמנית. הסיבות להופעת פסים לא ספציפיים הן: ראשית, הפריימרים אינם משלימים לחלוטין לרצף היעד, או שהפריימרים מתקבצים ליצירת דימרים. הסיבה השנייה היא שריכוז יוני Mg2+ גבוה מדי, טמפרטורת החישול נמוכה מדי ומספר מחזורי ה-PCR גבוה מדי. הגורם השני הוא איכות וכמות האנזים. אנזימים ממקורות מסוימים נוטים לרוב לרצועות לא ספציפיות אך אנזימים ממקורות אחרים לא. כמויות מוגזמות של אנזימים עלולות לפעמים להוביל להגברה לא ספציפית. אמצעי הנגד כוללים: עיצוב מחדש של פריימרים במידת הצורך. הפחיתו את כמות האנזים או החליפו אותו במקור אחר. הפחיתו את כמות הפריימרים, הגדילו את כמות התבנית כראוי והקטינו את מספר המחזורים. הגדל את טמפרטורת החישול כראוי או השתמש בשיטת שתי טמפרטורות נקודות (דנטורציה ב-93 מעלות צלזיוס, חישול והרחבה סביב 65 מעלות צלזיוס).

 

4. גרירה מתקלפת או מריחות מופיעות הגברה של PCR מופיעה לפעמים כרצועות מרוחות, פסים דמויי סדין או פסים דמויי שטיח. הסיבות נגרמות לרוב על ידי יותר מדי אנזים או איכות ירודה של האנזים, ריכוז dNTP גבוה מדי, ריכוז Mg2+ גבוה מדי, טמפרטורת חישול נמוכה מדי ומחזורים רבים מדי. אמצעי הנגד כוללים: ① הפחתת כמות האנזים, או החלפת האנזים במקור אחר. ②הפחת את הריכוז של dNTP. להפחית כראוי את ריכוז Mg2+. הגדל את כמות התבניות והקטין את מספר המחזורים