La SPE esiste da decenni e per una buona ragione. Quando gli scienziati vogliono rimuovere i componenti di fondo dai loro campioni, si trovano ad affrontare la sfida di farlo senza ridurre la loro capacità di determinare in modo accurato e preciso la presenza e la quantità del composto di interesse. La SPE è una tecnica che gli scienziati spesso utilizzano per preparare i campioni per la sensibile strumentazione utilizzata per l'analisi quantitativa. SPE è robusto, funziona per un'ampia gamma di tipi di campioni e nuovi prodotti e metodi SPE continuano a essere sviluppati. Al centro dello sviluppo di questi metodi c'è la consapevolezza che, anche se la parola “cromatografia” non appare nel nome della tecnica, la SPE è comunque una forma di separazione cromatografica.

SPE: La cromatografia silenziosa

C'è un vecchio detto "se un albero cade in una foresta e nessuno è in giro a sentirlo, emette comunque un suono?" Questo detto ci ricorda SPE. Potrebbe sembrare strano da dire, ma quando pensiamo alla SPE, la domanda diventa: "se avviene una separazione e non c'è nessun rilevatore per registrarla, la cromatografia è realmente avvenuta?" Nel caso di SPE, la risposta è un sonoro “sì!” Quando si sviluppa o si risolve un problema con un metodo SPE, può essere molto utile ricordare che SPE è semplicemente una cromatografia senza cromatogramma. Se ci pensate, Mikhail Tsvet, noto come "il padre della cromatografia", non stava forse facendo quello che oggi chiameremmo "SPE"? Quando separava le sue miscele di pigmenti vegetali lasciando che la gravità li trasportasse, disciolti in un solvente, attraverso un letto di gesso macinato, era molto diverso da un moderno metodo SPE?

Comprendere il tuo campione

Poiché la SPE si basa su principi cromatografici, al centro di ogni buon metodo SPE c'è la relazione tra gli analiti, la matrice, la fase stazionaria (l'adsorbente SPE) e la fase mobile (i solventi utilizzati per lavare o eluire il campione) .

Comprendere il più possibile la natura del campione è il punto di partenza migliore se devi sviluppare o risolvere i problemi di un metodo SPE. Per evitare tentativi ed errori inutili durante lo sviluppo del metodo, è molto utile la descrizione delle proprietà fisiche e chimiche sia degli analiti che della matrice. Una volta che conosci il tuo campione, sarai in una posizione migliore per abbinare quel campione con un prodotto SPE appropriato. Ad esempio, conoscere la polarità relativa degli analiti rispetto tra loro e rispetto alla matrice può aiutare a decidere se utilizzare la polarità per separare gli analiti dalla matrice è l'approccio giusto. Sapere se i tuoi analiti sono neutri o possono esistere in stati carichi può anche aiutarti a indirizzarti verso prodotti SPE specializzati nel trattenere o eluire specie neutre, caricate positivamente o caricate negativamente. Questi due concetti rappresentano due delle proprietà degli analiti più comunemente utilizzate da sfruttare durante lo sviluppo di metodi SPE e la selezione dei prodotti SPE. Se riesci a descrivere i tuoi analiti e i principali componenti della matrice in questi termini, sei sulla buona strada per scegliere una buona direzione per lo sviluppo del tuo metodo SPE.

Separazione per affinità

I principi che definiscono le separazioni che avvengono all'interno di una colonna LC, ad esempio, sono in gioco in una separazione SPE. Il fondamento di qualsiasi separazione cromatografica è stabilire un sistema che presenti vari gradi di interazione tra i componenti del campione e le due fasi presenti nella colonna o nella cartuccia SPE, la fase mobile e la fase stazionaria.

Uno dei primi passi per sentirsi a proprio agio con lo sviluppo del metodo SPE è avere familiarità con i due tipi di interazioni più comunemente riscontrate impiegate nella separazione SPE: polarità e/o stato di carica.

Polarità

Se utilizzerai la polarità per pulire il tuo campione, una delle prime scelte che devi fare è decidere quale “modalità” è la migliore. È meglio lavorare con un mezzo SPE relativamente polare e una fase mobile relativamente non polare (ovvero modalità normale) o, al contrario, un mezzo SPE relativamente non polare accoppiato con una fase mobile relativamente polare (ovvero modalità inversa, così chiamata proprio perché è l'opposto della “modalità normale” inizialmente stabilita).

Mentre esplori i prodotti SPE, scoprirai che le fasi SPE esistono in una gamma di polarità. Inoltre, la scelta del solvente della fase mobile offre anche un'ampia gamma di polarità, spesso molto sintonizzabili attraverso l'uso di miscele di solventi, tamponi o altri additivi. È possibile ottenere un elevato grado di precisione quando si utilizzano le differenze di polarità come caratteristica chiave da sfruttare per separare gli analiti dalle interferenze della matrice (o gli uni dagli altri).

Tieni a mente il vecchio adagio della chimica “il simile dissolve il simile” quando consideri la polarità come motore della separazione. Più un composto è simile alla polarità di una fase mobile o stazionaria, maggiore è la probabilità che interagisca in modo più forte. Interazioni più forti con la fase stazionaria portano a ritenzioni più lunghe sul mezzo SPE. Forti interazioni con la fase mobile portano ad una minore ritenzione e ad un'eluizione più precoce.

Stato di carica

Se gli analiti di interesse esistono sempre in uno stato carico o possono essere messi in uno stato carico dalle condizioni della soluzione in cui sono disciolti (ad esempio pH), allora un altro potente mezzo per separarli dalla matrice (o ciascuno altro) è attraverso l'utilizzo di media SPE in grado di attrarli con una carica propria.

In questo caso valgono le classiche regole dell’attrazione elettrostatica. A differenza delle separazioni che si basano sulle caratteristiche di polarità e sul modello di interazioni “il simile dissolve il simile”, le interazioni con stati carichi operano secondo la regola dell’”attrazione degli opposti”. Ad esempio, potresti avere un mezzo SPE che ha una carica positiva sulla sua superficie. Per bilanciare quella superficie caricata positivamente, tipicamente è inizialmente legata ad essa una specie caricata negativamente (un anione). Se l'analita caricato negativamente viene introdotto nel sistema, ha la capacità di spostare l'anione inizialmente legato e di interagire con la superficie SPE caricata positivamente. Ciò si traduce nella ritenzione dell'analita nella fase SPE. Questo scambio di anioni è chiamato “Scambio anionico” ed è solo un esempio della più ampia categoria di prodotti SPE “Scambio ionico”. In questo esempio, le specie caricate positivamente avrebbero un forte incentivo a rimanere nella fase mobile e a non interagire con la superficie SPE caricata positivamente, quindi non verrebbero trattenute. E, a meno che la superficie SPE non avesse altre caratteristiche oltre alle proprietà di scambio ionico, anche le specie neutre verrebbero mantenute in minima parte (sebbene esistano tali prodotti SPE miscelati, che consentono di utilizzare meccanismi di scambio ionico e di ritenzione di fase inversa nello stesso mezzo SPE ).

Una distinzione importante da tenere presente quando si impiegano meccanismi di scambio ionico è la natura dello stato di carica dell'analita. Se l'analita è sempre carico, indipendentemente dal pH della soluzione in cui si trova, è considerato una specie “forte”. Se l'analita viene caricato solo in determinate condizioni di pH, è considerato una specie “debole”. Questa è una caratteristica importante da comprendere sui tuoi analiti perché determinerà quale tipo di terreno SPE utilizzare. In termini generali, pensare che gli opposti vadano insieme aiuterà qui. Si consiglia di accoppiare un adsorbente SPE a scambio ionico debole con una specie “forte” e un adsorbente a scambio ionico forte con un analita “debole”.