La separazione e purificazione delle proteine ​​è ampiamente utilizzata nella ricerca e nelle applicazioni biochimiche e costituisce un'importante competenza operativa. Una tipica cellula eucariotica può contenere migliaia di proteine ​​diverse, alcune sono molto ricche e altre ne contengono solo poche copie. Per studiare un certoproteina, è necessario prima purificare la proteina da altre proteine ​​e molecole non proteiche.

1. Metodo di salatura diproteina:

Il sale neutro ha un effetto significativo sulla solubilità delle proteine. Generalmente, con l'aumento della concentrazione di sale a bassa concentrazione di sale, aumenta la solubilità delle proteine. Questa si chiama salatura; quando la concentrazione di sale continua ad aumentare, la solubilità delle proteine ​​diminuisce in misura diversa e si separano una dopo l'altra. Questo fenomeno è chiamato salatura.

2. Metodo di impilamento dei punti isoelettrici:

La repulsione elettrostatica tra le particelle è minima quando la proteina è statica, quindi anche la solubilità è minima. I punti isoelettrici delle varie proteine ​​sono diversi. Il pH della soluzione condizionante può essere utilizzato per raggiungere il punto isoelettrico di una proteina e accumularla, ma questo metodo è usato raramente da solo e può essere combinato con il metodo della salatura.

3.Dialisi e ultrafiltrazione:

La dialisi utilizza una membrana semipermeabile per separare proteine ​​di diverse dimensioni molecolari. Il metodo di ultrafiltrazione utilizza l'alta pressione o forza centrifuga per far passare l'acqua e altre piccole molecole di soluto attraverso una membrana semipermeabile, mentre ilproteinarimane sulla membrana. È possibile scegliere diverse dimensioni dei pori per intercettare proteine ​​di diverso peso molecolare.

4.Metodo di filtrazione del gel:

Chiamata anche cromatografia ad esclusione dimensionale o cromatografia a setaccio molecolare, questo è uno dei metodi più utili per separare le miscele proteiche in base alla dimensione molecolare. I materiali di imballaggio più comunemente utilizzati nella colonna sono il gel di glucosio (Sephadex ged) e il gel di agarosio (gel di agarosio).

5.Elettroforesi:

Nelle stesse condizioni di pH, diverse proteine ​​possono essere separate a causa dei loro diversi pesi molecolari e delle diverse cariche nel campo elettrico. Vale la pena prestare attenzione all'elettroforesi isoelettrica, che utilizza un anfolita come vettore. Durante l'elettroforesi, l'anfolita forma un gradiente di pH aggiunto gradualmente dall'elettrodo positivo all'elettrodo negativo. Quando le proteine ​​​​con una certa carica nuotano al suo interno, si raggiungeranno a vicenda. La posizione del pH del punto elettrico è discontinua e questo metodo può essere utilizzato per analizzare e preparare varie proteine.

6.Cromatografia a comunicazione ionica:

gli agenti di comunicazione ionica includono agenti di comunicazione cationici (come carbossimetilcellulosa; CM-cellulosa) e agenti di comunicazione anionici (dietilamminoetilcellulosa). Quando passa attraverso la colonna per cromatografia a comunicazione ionica, la proteina con carica opposta all'agente di comunicazione ionica viene adsorbita sull'agente di comunicazione ionica e quindi la proteina adsorbitaproteinaviene eluito modificando il pH o la forza ionica.

7. Cromatografia di affinità:

La cromatografia di affinità è un metodo estremamente utile per separare le proteine. Spesso è necessario un solo passaggio per separare una determinata proteina da purificare da una miscela proteica disordinata ad elevata purezza.

Questo metodo si basa sul legame specifico anziché covalente di alcune proteine ​​con un'altra molecola chiamata ligando (Ligand).

Il principio fondamentale:

le proteine ​​esistono in una miscela disordinata nei tessuti o nelle cellule e ogni tipo di cellula contiene migliaia di proteine ​​diverse. Pertanto, la distinzione tra proteine ​​è una parte importante della biochimica, e non è stata l’unica. Oppure una serie di metodi già pronti può rimuovere qualsiasi tipo di proteina da una proteina mista disordinata, quindi diversi metodi vengono spesso utilizzati in combinazione.