Algengar spurningar um PCR 1. Fölsk neikvæð, ekkert mögnunarsvið birtist 2. Fölskt jákvætt 3. Ósértæk mögnunarbönd birtast 4. Flakandi dragstrimlar eða strokræmur birtast：

1Fölsk neikvæð, ekkert magnað band birtist Lykilatriði PCR viðbragðsins eru

① undirbúningur sniðmátkjarnsýru

② grunnur gæði og sérhæfni

③ ensím gæði og

④ PCR hringrás skilyrði. Til að finna ástæðurnar ætti einnig að gera greiningu og rannsóknir á ofangreindum hlekkjum.

Sniðmát:

① Sniðmátið inniheldur óhreinindi prótein

② Sniðmátið inniheldur Taq ensímhemla

③ Próteinin í sniðmátinu eru ekki melt og fjarlægð, sérstaklega histónin í litningum

④ Of mikið tapaðist við útdrátt og undirbúning sniðmátsins, eða fenól var andað að sér

⑤Kjarnsýran í sniðmátinu er ekki algjörlega eðlislæg. Þegar gæði ensíma og primers eru góð, ef mögnunarbönd koma ekki fram, er líklegast að eitthvað sé að meltingarferli sýnisins eða sniðmátkjarnsýruútdráttarferlinu. Þess vegna verður að útbúa áhrifaríka og stöðuga meltingarlausn og aðferðin ætti að vera fest og ætti ekki að breyta að vild. . Ensímóvirkjun: Nauðsynlegt er að skipta út nýja ensíminu, eða nota bæði gamalt og nýtt ensím á sama tíma til að greina hvort rangar neikvæðar eru af völdum taps eða ófullnægjandi ensímvirkni. Það skal tekið fram að stundum gleymist Taq ensímið.Primers: Primer gæði, grunnur styrkur og hvort styrkur primeranna tveggja sé samhverfur eru algengar ástæður fyrir PCR bilun eða ófullnægjandi mögnunarböndum og auðveldri dreifingu. Það eru vandamál með gæði grunngerðar í sumum lotum. Annar af primerunum tveimur hefur háan styrk og hinn hefur lágan styrk, sem leiðir til lítillar skilvirkni ósamhverfa mögnunar.

Mótvægisaðgerðirnar eru:

① Veldu góða grunnunareiningu.

② Styrkur primers ætti ekki aðeins að líta á OD gildi, heldur einnig að huga að grunnlausninni fyrir agarósa gel rafdrætti. Það verða að vera grunnlínur og birtustig beggja grunnlínanna ætti að vera nokkurn veginn það sama. Til dæmis er einn grunnurinn með band og hinn grunnurinn hefur ekkert band. Fyrir strimla getur PCR mistekist á þessum tíma og ætti að leysa það með samningaviðræðum við grunngerðareininguna. Ef annar grunnurinn hefur mikla birtu og hinn með lágan birtu, jafnvægi styrkinn þegar þú þynnir grunninn.

③ Grunnur ætti að geyma í miklum styrk og litlu magni til að koma í veg fyrir endurtekna frystingu og þíðingu eða langtímageymslu í kæli, sem getur leitt til rýrnunar og niðurbrots á grunninum.

④ Grunnhönnunin er ósanngjörn, svo sem að lengd grunnsins er ekki næg, dimerar myndast á milli grunna osfrv. Mg2+ styrkur: Mg2+ jónastyrkur hefur mikil áhrif á PCR mögnunarvirkni. Ef styrkurinn er of hár getur það dregið úr sértækni PCR mögnunar. Ef styrkurinn er of lágur mun það hafa áhrif á afrakstur PCR mögnunar og jafnvel valda því að PCR mögnun mistekst án þess að magna bönd. Breytingar á hvarfmagni: Venjulega eru rúmmálin sem notuð eru fyrir PCR mögnun 20 ul, 30 ul og 50 ul. Eða 100ul, hvaða rúmmál ætti að nota til PCR mögnunar er stillt í samræmi við mismunandi tilgang vísindarannsókna og klínískra prófana. Eftir að hafa búið til lítið magn, eins og 20ul, og síðan búið til meira magn, verður þú að fylgja skilyrðunum, annars mun það auðveldlega mistakast. Líkamlegar ástæður: Eðlismyndun er mjög mikilvæg fyrir PCR mögnun. Ef afeitunarhitastigið er lágt og afeitunartíminn er stuttur, er mjög líklegt að rangar neikvæðar komi fram; glæðingarhitastigið er of lágt, sem getur valdið ósértækri mögnun og dregið úr sértækri mögnunarvirkni. Hreinsunarhitastigið er of hátt. Hefur mikil áhrif á bindingu primers við sniðmát og dregur úr PCR mögnunarvirkni. Stundum er nauðsynlegt að nota staðlaðan hitamæli til að athuga eðlisbreytingar-, glæðingar- og framlengingarhitastig í magnaranum eða vatnsleysanlegu pottinum. Þetta er líka ein af ástæðunum fyrir PCR bilun. Breytileiki markraðar: Ef markröðin er stökkbreytt eða eytt, sem hefur áhrif á sértæka bindingu primersins við sniðmátið, eða primerinn og sniðmátið missa viðbótarröðina vegna eyðingar á ákveðnum hluta af markröðinni, mun PCR mögnunin. mun ekki ná árangri.

2.falskt jákvætt PCR mögnunarbandið sem birtist er í samræmi við markraðarbandið og stundum er bandið skipulegra og bjartara. Óviðeigandi grunnhönnun: Valin mögnunarröð hefur samsvörun við mögnunarröðina sem ekki er markhópur, þannig að þegar PCR mögnun er framkvæmd er magnaða PCR afurðin ekki markröð. Ef markröðin er of stutt eða primerinn er of stuttur geta falskar jákvæðar auðveldlega komið fram. Grunnur þarf að endurhanna. Krossmengun á markröðum eða mögnunarafurðum: Það eru tvær ástæður fyrir þessari mengun: Í fyrsta lagi víxlamengun á öllu erfðamenginu eða stórum bútum, sem leiðir til falskra jákvæðra. Þessa falsku jákvæðu er hægt að leysa með eftirfarandi aðferðum: Vertu varkár og varkár við notkun til að koma í veg fyrir að markröðin sogist inn í sýnisbyssuna eða skvettist út úr skilvindurörinu. Fyrir utan ensím og efni sem þola ekki háan hita, skal sótthreinsa öll hvarfefni eða búnaður með háum þrýstingi. Öll miðflóttaglös og sýnishornspípettupípu skal nota einu sinni. Ef nauðsyn krefur eru hvarfglösin og hvarfefnin geisluð með útfjólubláu ljósi áður en sýninu er bætt við til að eyða kjarnsýrunum sem eru til staðar. Annað er mengun lítilla kjarnsýrubúta í loftinu. Þessir litlu brot eru styttri en markröðin, en hafa ákveðna samlíkingu. Hægt er að splæsa þeim hvert við annað og eftir að hafa verið viðbót við primerana er hægt að magna PCR afurðirnar, sem leiðir til rangra jákvæða, sem hægt er að draga úr eða útrýma með hreiðri PCR aðferðum.

 

3. Ósértæk mögnunarbönd birtast Böndin sem koma fram eftir PCR mögnun eru í ósamræmi við væntanleg stærð, annaðhvort stærri eða minni, eða bæði sértæk mögnunarbönd og ósértæk mögnunarbönd koma fram á sama tíma. Ástæðurnar fyrir því að ósérhæfðar bönd birtast eru: Í fyrsta lagi eru primerarnir ekki fullkomlega viðbótir við markröðina, eða primerarnir safnast saman til að mynda dimera. Önnur ástæðan er sú að Mg2+ jónastyrkurinn er of hár, glæðingarhitastigið er of lágt og fjöldi PCR lota er of hár. Annar þátturinn er gæði og magn ensímsins. Ensím frá sumum uppruna eru oft viðkvæm fyrir ósértækum böndum en ensím frá öðrum uppsprettum gera það ekki. Of mikið magn af ensímum getur stundum leitt til ósértækrar mögnunar. Mótvægisaðgerðirnar fela í sér: endurhanna grunna ef þörf krefur. Dragðu úr magni ensíms eða skiptu því út fyrir aðra uppsprettu. Minnkaðu magn primers, aukið magn sniðmáts á viðeigandi hátt og minnkaðu fjölda lota. Hækkaðu útgræðsluhitastigið á viðeigandi hátt eða notaðu tveggja hitastigspunktaaðferðina (eðlun við 93°C, glæðing og framlenging um 65°C).

 

4. Flaky drag eða strok birtast PCR mögnun birtist stundum sem smeared bönd, lak-eins bönd eða teppa-eins bönd. Ástæðurnar stafa oft af of miklu ensími eða lélegum gæðum ensíms, of háum dNTP styrk, of háum Mg2+ styrk, of lágum glæðingarhita og of mörgum lotum. Mótráðstafanirnar fela í sér: ① Dragðu úr magni ensíms, eða skiptu ensíminu út fyrir aðra uppsprettu. ② Dragðu úr styrk dNTP. Dragðu úr styrk Mg2+ á viðeigandi hátt. Auktu magn sniðmáta og minnkaðu fjölda lota