PCR FAQ 1. Ụgha na-adịghị mma, ọ dịghị ụda mmụba na-egosi 2. Ụgha dị mma 3. Mgbagwoju ụda na-adịghị akọwapụta 4. Mpekere dị nro na-adọrọ adọrọ ma ọ bụ smear ibe apụta:

1Ihe na-adịghị mma, ọ nweghị eriri agbagoro pụtara Isi akụkụ nke mmeghachi omume PCR bụ

① nkwadebe nke template nucleic acid

② primer àgwà na kpọmkwem

③ mma enzyme na

④ Ọnọdụ okirikiri PCR. Iji chọpụta ihe kpatara ya, ekwesịrị ịme nyocha na nyocha na njikọ ndị dị n'elu.

Template:

① Ihe ndebiri nwere protein adịghị ọcha

② Ihe ndebiri nwere ihe mgbochi enzyme Taq

③ A naghị agbaze ma wepụ protein ndị dị na template, karịsịa histones na chromosomes.

④ Ọtụtụ furu efu n'oge mmịpụta na nkwadebe nke ndebiri, ma ọ bụ kuru phenol

⑤The template nucleic acid na-adịghị kpamkpam denatured. Mgbe ogo nke enzymes na primers dị mma, ọ bụrụ na eriri amplification adịghị apụta, ọ ga-abụ na ọ nwere ihe na-ezighị ezi na usoro mgbaze nke ihe atụ ma ọ bụ template nucleic acid usoro mmịpụta. Ya mere, a ghaghị ịkwado ngwọta mgbaze dị irè ma kwụsie ike, na usoro ahụ kwesịrị idozi ma ghara ịgbanwe ya na ọchịchọ. . Enzyme inactivation: Ọ dị mkpa iji dochie enzyme ọhụrụ, ma ọ bụ jiri ma ochie na nke ọhụrụ enzymes n'otu oge iji nyochaa ma ọ bụ ọnwụ ma ọ bụ ezughị ezu ọrụ enzyme kpatara. Ekwesiri iburu n'uche na mgbe ụfọdụ a na-echefu enzyme Taq. Ndị na-emepụta ihe: àgwà nke mbụ, ntinye uche nke mbụ, na ma ntinye nke primers abụọ ahụ bụ ihe na-emekarị maka ọdịda PCR ma ọ bụ ihe ndị na-adịghị mma nke ukwuu na mgbasa ozi dị mfe. Enwere nsogbu na ogo nhazi nke primer na ụfọdụ batches. Otu n'ime primers abụọ ahụ nwere ọkwa dị elu na nke ọzọ nwere obere ntinye uche, na-eme ka ọ bụrụ ihe na-eme ka asymmetric dịkwuo ala.

Usoro mgbochi bụ:

① Họrọ otu njiri mara nke ọma.

② Ntinye uche nke primers ekwesịghị ile anya na uru OD, kamakwa ṅaa ntị na ngwọta ngwaahịa primer maka agarose gel electrophoresis. A ga-enwerịrị eriri primer, na nchapụta nke eriri primer abụọ kwesịrị ịbụ otu. Dịka ọmụmaatụ, otu primer nwere band na nke ọzọ enweghị eriri. Maka ibe, PCR nwere ike daa n'oge a ma ekwesịrị idozi ya site na mkparita uka na ngalaba njikọ primer. Ọ bụrụ na otu primer nwere nchapụta dị elu ma nke ọzọ nwere nchapụta dị ala, dozie nleba anya mgbe ị na-agbaze primers.

③ Ekwesịrị ịchekwa primers na nnukwu itinye uche na obere nha iji gbochie oyi na-agbaze ugboro ugboro ma ọ bụ nchekwa ogologo oge na friji, nke nwere ike ibute mmebi na mmebi nke primers.

④ The primer imewe bụ ihe ezi uche na-adịghị, dị ka primer ogologo ezughị, dimers na-guzobere n'etiti primers, wdg Mg2 + ntinye uche: Mg2 + ion ịta ahụhụ nwere mmetụta dị ukwuu na PCR amplification arụmọrụ. Ọ bụrụ na ntinye uche dị oke elu, ọ nwere ike ibelata nkọwapụta PCR. Ọ bụrụ na itinye uche dị oke ala, ọ ga-emetụta mkpụrụ njupụta PCR na ọbụna mee ka PCR amplification daa na-enweghị ịgba egwu. Mgbanwe na olu mmeghachi omume: Ọtụtụ mgbe, mpịakọta a na-eji maka nkwalite PCR bụ 20ul, 30ul, na 50ul. Ma ọ bụ 100ul, ihe olu kwesịrị iji maka nkwalite PCR ka edobere dịka ebumnuche dị iche iche nke nyocha sayensị na nyocha ụlọ ọgwụ. Mgbe ịmechara obere olu, dị ka 20ul, wee mee ka ụda buru ibu, ị ga-agbaso ọnọdụ ndị ahụ, ma ọ bụghị ya, ọ ga-ada ngwa ngwa. Ihe kpatara anụ ahụ: Denaturation dị ezigbo mkpa maka nkwalite PCR. Ọ bụrụ na denaturation okpomọkụ dị ala na denaturation oge dị mkpụmkpụ, ụgha ọjọọ nwere ike ime; okpomọkụ na-ekpo ọkụ dị oke ala, nke nwere ike ime ka mmụba na-abụghị nke a na-akọwapụta ma belata arụmọrụ nkwalite kpọmkwem. Okpomọkụ annealing dị oke elu. Na-emetụta nke ukwuu njikọ nke primers na ndebiri ma na-ebelata arụmọrụ PCR. Mgbe ụfọdụ, ọ dị mkpa iji ọkọlọtọ temometa iji lelee denaturation, annealing na mgbatị okpomọkụ na amplifier ma ọ bụ mmiri-soluble ite. Nke a bụkwa otu n'ime ihe kpatara ọdịda PCR. Mgbanwe nke usoro ebumnuche: Ọ bụrụ na agbanweela ma ọ bụ hichapụ usoro ebumnuche ebumnuche, nke na-emetụta njide kpọmkwem nke primer na template, ma ọ bụ primer na template tụfuru usoro mmekọ ahụ n'ihi nhichapụ nke akụkụ ụfọdụ nke usoro ebumnuche, nkwalite PCR. agaghị aga nke ọma.

2.false positive The PCR amplification band nke na-egosi na-agbanwe agbanwe na lekwasịrị anya usoro gbalaga, na mgbe ụfọdụ, ìgwè ndị ọzọ n'usoro na chawapụrụ. Nhazi primer na-ekwesịghị ekwesị: Usoro nkwalite ahọpụtara nwere homology nwere usoro mmụba na-abụghị ebumnuche, yabụ mgbe ị na-eme nkwalite PCR, ngwaahịa PCR agbagoro bụ usoro na-abụghị ebumnuche. Ọ bụrụ na usoro ebumnuche dị oke mkpụmkpụ ma ọ bụ primer dị mkpụmkpụ, ezigbo ụgha nwere ike ime ngwa ngwa. Ọ dị mkpa ka emegharịa ntọala mbụ. Mmebi nke usoro ebumnuche ma ọ bụ ngwaahịa nkwalite: Enwere ihe abụọ kpatara mmetọ a: Nke mbụ, mmetọ nke genome dum ma ọ bụ iberibe iberibe buru ibu, na-eduga na nhụsianya ụgha. Enwere ike dozie ihe dị mma a site na ụzọ ndị a: Kpachapụ anya ma dị nwayọọ mgbe ị na-arụ ọrụ iji gbochie usoro a chọrọ ka etinye ya n'ime egbe nlele ma ọ bụ fesa ya na tube centrifuge. Ewezuga enzymes na ihe ndị na-enweghị ike iguzogide oke okpomọkụ, ihe niile reagents ma ọ bụ akụrụngwa kwesịrị ịgba ọgwụ mgbochi site na nnukwu nrụgide. Ekwesịrị iji tubes centrifuge niile na ndụmọdụ pipette ntụ ntụ mee otu ugboro. Ọ bụrụ na ọ dị mkpa, a na-eji ọkụ ultraviolet na-amụba tubes mmeghachi omume na reagents tupu ịtinye ihe atụ iji bibie acid nucleic dị ugbu a. Nke abụọ bụ mmetọ nke obere iberibe nucleic acid na ikuku. Iberibe ndị a dị mkpụmkpụ karịa usoro ebumnuche, mana nwere ụfọdụ homology. Enwere ike kewaa ha n'otu n'otu, na mgbe ha nwesịrị nkwado na primers, ngwaahịa PCR nwere ike ịbawanyewanye, na-ebute nsonaazụ ụgha, nke nwere ike belata ma ọ bụ kpochapụ site na ụzọ PCR akwụghị ụgwọ.

 

3.Non-specific amplification bands na-apụta Mgbagwoju anya nke na-apụta mgbe nkwalite PCR na-ekwekọghị na nha a na-atụ anya ya, ma ọ bụ ibu ma ọ bụ obere, ma ọ bụ ma ọnyà abụọ a kapịrị ọnụ na-apụtaghị ìhè n'otu oge. Ihe kpatara ọdịdị nke eriri ndị na-abụghị nke a kapịrị ọnụ bụ: nke mbụ, ndị na-emepụta ihe anaghị akwado kpamkpam n'usoro ebumnuche, ma ọ bụ primers na-agbakọta iji mepụta dimers. Ihe kpatara ya nke abụọ bụ na ntinye Mg2+ ion dị oke elu, okpomọkụ na-ekpo ọkụ dị oke ala, ọnụ ọgụgụ nke PCR cycles dịkwa elu. Ihe nke abụọ bụ àgwà na ọnụọgụ nke enzyme. Enzymes sitere na isi mmalite ụfọdụ na-adịkarị mfe na eriri ndị na-abụghị nke akọwapụtara mana enzymes sitere na isi mmalite ndị ọzọ adịghị. Ịba ụba nke enzymes nwere ike mgbe ụfọdụ na-ebute mmụba na-abụghị nke a kapịrị ọnụ. Usoro mgbochi gụnyere: megharịa primers ma ọ bụrụ na ọ dị mkpa. Belata ọnụọgụ nke enzyme ma ọ bụ jiri isi iyi ọzọ dochie ya. Belata ọnụ ọgụgụ nke primers, mee ka ọnụọgụ nke ndebiri dị mma, ma belata ọnụ ọgụgụ nke okirikiri. Mee ka ọnọdụ okpomọkụ dịkwuo elu nke ọma ma ọ bụ jiri usoro ihe ọkụ ọkụ abụọ (denaturation na 93 ° C, annealing na mgbatị gburugburu 65 ° C).

 

4.Flaky ịdọrọ ma ọ bụ smears egosi PCR amplification mgbe ụfọdụ na-egosi dị ka smeared ìgwè, mpempe akwụkwọ-dị ka ìgwè ma ọ bụ kapeeti-dị ka ìgwè. A na-ebutekarị ihe kpatara ya site na oke enzyme ma ọ bụ adịghị mma nke enzyme, itinye uche dNTP dị elu, oke Mg2+ dị elu, okpomọkụ na-adịghị ala ala, na ọtụtụ okirikiri. Usoro mgbochi gụnyere: ① Belata ọnụọgụ nke enzyme, ma ọ bụ jiri isi iyi ọzọ dochie enzyme ahụ. ②Welata mkpokọta dNTP. Jiri nwayọ belata mkpokọta Mg2+ nke ọma. Mụbaa ọnụọgụ ndebiri ma belata ọnụọgụ okirikiri