FAQ PCR 1. Negatif palsu, tidak ada pita amplifikasi yang muncul 2. Positif palsu 3. Muncul pita amplifikasi non-spesifik 4. Strip tarik atau strip noda yang terkelupas muncul：

1Negatif palsu, tidak ada pita yang diperkuat yang muncul Aspek kunci dari reaksi PCR adalah

① persiapan asam nukleat templat

② kualitas dan spesifisitas primer

③ kualitas enzim dan

④ Kondisi siklus PCR. Untuk mengetahui alasannya, analisis dan penelitian juga harus dilakukan pada tautan di atas.

Templat:

① Templat mengandung protein pengotor

② Templat mengandung inhibitor enzim Taq

③ Protein dalam cetakan tidak dicerna dan dikeluarkan, terutama histon dalam kromosom

④ Terlalu banyak fenol yang hilang selama ekstraksi dan persiapan templat, atau fenol terhirup

⑤Asam nukleat templat tidak terdenaturasi sepenuhnya. Apabila kualitas enzim dan primer baik, jika tidak muncul pita amplifikasi, kemungkinan besar terjadi kesalahan pada proses pencernaan spesimen atau proses ekstraksi asam nukleat template. Oleh karena itu, larutan pencernaan yang efektif dan stabil harus disiapkan, dan prosedurnya harus diperbaiki dan tidak boleh diubah sesuka hati. . Inaktivasi enzim: Penting untuk mengganti enzim baru, atau menggunakan enzim lama dan baru secara bersamaan untuk menganalisis apakah negatif palsu disebabkan oleh hilangnya atau kurangnya aktivitas enzim. Perlu dicatat bahwa terkadang enzim Taq dilupakan. Primer: Kualitas primer, konsentrasi primer, dan apakah konsentrasi kedua primer simetris merupakan alasan umum kegagalan PCR atau pita amplifikasi yang tidak memuaskan dan difusi yang mudah. Terdapat masalah dengan kualitas sintesis primer di beberapa batch. Salah satu dari dua primer memiliki konsentrasi tinggi dan yang lainnya memiliki konsentrasi rendah, sehingga menghasilkan amplifikasi asimetris dengan efisiensi rendah.

Upaya penanggulangannya adalah:

① Pilih unit sintesis primer yang baik.

② Konsentrasi primer tidak hanya harus melihat nilai OD saja, tetapi juga memperhatikan larutan stok primer untuk elektroforesis gel agarosa. Harus ada pita primer, dan kecerahan kedua pita primer harus kira-kira sama. Misalnya, satu primer memiliki pita dan primer lainnya tidak memiliki pita. Untuk strip, PCR mungkin gagal saat ini dan harus diselesaikan melalui negosiasi dengan unit sintesis primer. Jika satu primer memiliki kecerahan tinggi dan primer lainnya memiliki kecerahan rendah, seimbangkan konsentrasinya saat mengencerkan primer.

③ Primer harus disimpan dalam konsentrasi tinggi dan jumlah kecil untuk mencegah pembekuan dan pencairan berulang kali atau penyimpanan jangka panjang di lemari es, yang dapat menyebabkan kerusakan dan degradasi primer.

④Desain primer tidak masuk akal, seperti panjang primer tidak cukup, dimer terbentuk di antara primer, dll. Konsentrasi Mg2+: Konsentrasi ion Mg2+ memiliki pengaruh besar terhadap efisiensi amplifikasi PCR. Jika konsentrasinya terlalu tinggi dapat menurunkan spesifisitas amplifikasi PCR. Jika konsentrasinya terlalu rendah akan mempengaruhi hasil amplifikasi PCR bahkan menyebabkan kegagalan amplifikasi PCR tanpa pita penguat. Perubahan volume reaksi: Biasanya volume yang digunakan untuk amplifikasi PCR adalah 20ul, 30ul, dan 50ul. Atau 100ul, volume yang harus digunakan untuk amplifikasi PCR diatur sesuai dengan tujuan penelitian ilmiah dan uji klinis yang berbeda. Setelah membuat volume kecil, misalnya 20ul, kemudian membuat volume lebih besar, harus mengikuti ketentuan, jika tidak maka akan mudah gagal. Alasan fisik: Denaturasi sangat penting untuk amplifikasi PCR. Jika suhu denaturasi rendah dan waktu denaturasi singkat, kemungkinan besar akan terjadi negatif palsu; suhu anil terlalu rendah, yang dapat menyebabkan amplifikasi non-spesifik dan mengurangi efisiensi amplifikasi spesifik. Suhu anil terlalu tinggi. Sangat mempengaruhi pengikatan primer ke templat dan mengurangi efisiensi amplifikasi PCR. Kadang-kadang perlu menggunakan termometer standar untuk memeriksa suhu denaturasi, anil dan ekstensi dalam amplifier atau panci yang larut dalam air. Ini juga salah satu penyebab kegagalan PCR. Variasi urutan target: Jika urutan target bermutasi atau dihapus, yang mempengaruhi pengikatan spesifik primer ke templat, atau primer dan templat kehilangan urutan komplementer karena penghapusan segmen tertentu dari urutan target, amplifikasi PCR tidak akan berhasil.

2.positif palsu Pita amplifikasi PCR yang muncul konsisten dengan pita urutan target, dan terkadang pita tersebut lebih teratur dan terang. Desain primer yang tidak sesuai: Urutan amplifikasi yang dipilih memiliki homologi dengan urutan amplifikasi non-target, sehingga ketika melakukan amplifikasi PCR, produk PCR yang diamplifikasi adalah urutan non-target. Jika urutan target terlalu pendek atau primer terlalu pendek, hasil positif palsu dapat dengan mudah terjadi. Primer perlu didesain ulang. Kontaminasi silang pada rangkaian target atau produk amplifikasi: Ada dua alasan terjadinya kontaminasi ini: Pertama, kontaminasi silang pada seluruh genom atau fragmen besar, yang menyebabkan hasil positif palsu. Positif palsu ini dapat diatasi dengan metode berikut: Berhati-hatilah dan hati-hati saat mengoperasikannya untuk mencegah rangkaian target tersedot ke dalam pistol sampel atau terciprat keluar dari tabung sentrifugasi. Kecuali enzim dan zat yang tidak tahan suhu tinggi, semua reagen atau peralatan harus disterilkan dengan tekanan tinggi. Semua tabung sentrifugasi dan ujung pipet injeksi sampel harus digunakan satu kali. Jika perlu, tabung reaksi dan reagen diiradiasi dengan sinar ultraviolet sebelum menambahkan spesimen untuk menghancurkan asam nukleat yang ada. Yang kedua adalah kontaminasi pecahan kecil asam nukleat di udara. Fragmen kecil ini lebih pendek dari urutan target, namun memiliki homologi tertentu. Mereka dapat digabungkan satu sama lain, dan setelah melengkapi primer, produk PCR dapat diperkuat, sehingga menghasilkan positif palsu, yang dapat dikurangi atau dihilangkan dengan metode PCR bersarang.

 

3. Muncul pita amplifikasi non-spesifik Pita yang muncul setelah amplifikasi PCR tidak sesuai dengan ukuran yang diharapkan, baik lebih besar atau lebih kecil, atau pita amplifikasi spesifik dan pita amplifikasi non-spesifik muncul secara bersamaan. Alasan munculnya pita non-spesifik adalah: pertama, primer tidak sepenuhnya melengkapi urutan target, atau primer berkumpul membentuk dimer. Alasan kedua adalah konsentrasi ion Mg2+ terlalu tinggi, suhu annealing terlalu rendah, dan jumlah siklus PCR terlalu tinggi. Faktor kedua adalah kualitas dan kuantitas enzim. Enzim dari beberapa sumber seringkali rentan terhadap pita non-spesifik namun enzim dari sumber lain tidak. Jumlah enzim yang berlebihan terkadang dapat menyebabkan amplifikasi yang tidak spesifik. Penanggulangannya meliputi: mendesain ulang primer jika diperlukan. Kurangi jumlah enzim atau ganti dengan sumber lain. Kurangi jumlah primer, tambah jumlah templat dengan tepat, dan kurangi jumlah siklus. Tingkatkan suhu anil dengan tepat atau gunakan metode dua titik suhu (denaturasi pada 93°C, anil dan ekstensi sekitar 65°C).

 

4. Muncul serpihan atau noda. Amplifikasi PCR terkadang muncul sebagai pita berlumuran, pita seperti lembaran, atau pita seperti karpet. Penyebabnya seringkali disebabkan oleh terlalu banyak enzim atau kualitas enzim yang buruk, konsentrasi dNTP yang terlalu tinggi, konsentrasi Mg2+ yang terlalu tinggi, suhu annealing yang terlalu rendah, dan siklus yang terlalu banyak. Upaya penanggulangannya antara lain: ① Mengurangi jumlah enzim, atau mengganti enzim dengan sumber lain. ②Kurangi konsentrasi dNTP. Kurangi konsentrasi Mg2+ secara tepat. Tingkatkan jumlah templat dan kurangi jumlah siklus