PCR ՀՏՀ 1. Կեղծ բացասական, ուժեղացման գոտի չի հայտնվում 2. Կեղծ դրական 3. Ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման գոտիներ են հայտնվում 4. հայտնվում են շերտավոր ձգող շերտեր կամ քսման շերտեր.

1 Կեղծ բացասական, ուժեղացված գոտի չի հայտնվում ՊՇՌ ռեակցիայի հիմնական կողմերն են

① կաղապարի նուկլեինաթթվի պատրաստում

② այբբենարանի որակը և առանձնահատկությունը

③ ֆերմենտի որակը և

④ PCR ցիկլի պայմանները: Պատճառները գտնելու համար վերլուծություններ և հետազոտություններ պետք է կատարվեն նաև վերը նշված հղումներով։

Կաղապար:

① Կաղապարը պարունակում է կեղտոտ սպիտակուցներ

② Կաղապարը պարունակում է Taq ֆերմենտի ինհիբիտորներ

③ Կաղապարի սպիտակուցները չեն մարսվում և հեռացվում, հատկապես քրոմոսոմների հիստոնները

④ Կաղապարի արդյունահանման և պատրաստման ընթացքում շատ բան է կորել, կամ ֆենոլ է ներշնչվել

⑤ Կաղապարի նուկլեինաթթուն ամբողջությամբ դենատուրացված չէ: Երբ ֆերմենտների և պրայմերների որակը լավ է, եթե ուժեղացման գոտիները չեն երևում, ամենայն հավանականությամբ, ինչ-որ բան այն չէ նմուշի մարսողության կամ կաղապարի նուկլեինաթթվի արդյունահանման գործընթացում: Ուստի պետք է պատրաստել արդյունավետ և կայուն մարսողության լուծույթ, իսկ պրոցեդուրան պետք է ֆիքսել և ըստ ցանկության չփոխել։ . Ֆերմենտի ապաակտիվացում. անհրաժեշտ է փոխարինել նոր ֆերմենտը կամ միաժամանակ օգտագործել ինչպես հին, այնպես էլ նոր ֆերմենտները՝ վերլուծելու համար, թե արդյոք կեղծ բացասականները առաջանում են կորստի կամ ֆերմենտի անբավարար ակտիվության հետևանքով: Պետք է նշել, որ երբեմն մոռացվում է Taq ֆերմենտը: Պրայմերներ. պրայմերների որակը, պրայմերների կոնցենտրացիան և արդյոք երկու պրայմերների կոնցենտրացիաների սիմետրիկ լինելը PCR-ի ձախողման կամ անբավարար ուժեղացման գոտիների և հեշտ տարածման ընդհանուր պատճառներ են: Որոշ խմբաքանակներում այբբենարանի սինթեզի որակի հետ կապված խնդիրներ կան: Երկու այբբենարաններից մեկն ունի բարձր կոնցենտրացիա, իսկ մյուսը՝ ցածր, ինչը հանգեցնում է ցածր արդյունավետության ասիմետրիկ ուժեղացման:

Հակադարձ միջոցներն են.

① Ընտրեք լավ այբբենարանի սինթեզի միավոր:

② Պրայմերների կոնցենտրացիան ոչ միայն պետք է դիտարկի OD-ի արժեքը, այլև ուշադրություն դարձնի ագարոզայի գելային էլեկտրոֆորեզի պրայմերային լուծույթին: Պետք է լինեն այբբենարանի շերտեր, և երկու այբբենարանների պայծառությունը պետք է մոտավորապես նույնը լինի: Օրինակ, մի այբբենարան ունի ժապավեն, իսկ մյուս այբբենարանը չունի ժապավեն: Շերտերի դեպքում PCR-ն այս պահին կարող է ձախողվել և պետք է լուծվի պրայմերների սինթեզի միավորի հետ բանակցությունների միջոցով: Եթե ​​մի այբբենարան ունի բարձր պայծառություն, իսկ մյուսը ցածր պայծառություն, հավասարակշռեք կոնցենտրացիաները պրայմերները նոսրացնելիս:

③ Այբբենարանները պետք է պահվեն բարձր կոնցենտրացիաներում և փոքր քանակությամբ՝ կանխելու կրկնակի սառեցումը և հալեցումը կամ երկարաժամկետ պահպանումը սառնարանում, ինչը կարող է հանգեցնել պրայմերների քայքայման և քայքայման:

④ Այբբենարանի ձևավորումն անհիմն է, օրինակ՝ այբբենարանի երկարությունը բավարար չէ, պրայմերների միջև ձևավորվում են դիմերներ և այլն: Mg2+ կոնցենտրացիան. Mg2+ իոնի կոնցենտրացիան մեծ ազդեցություն ունի PCR ուժեղացման արդյունավետության վրա: Եթե ​​կոնցենտրացիան չափազանց բարձր է, դա կարող է նվազեցնել PCR ուժեղացման առանձնահատկությունը: Եթե ​​կոնցենտրացիան չափազանց ցածր է, դա կազդի PCR ուժեղացման ելքի վրա և նույնիսկ կհանգեցնի PCR ուժեղացման ձախողմանը, առանց ուժեղացման գոտիների: Ռեակցիայի ծավալի փոփոխություններ. Սովորաբար PCR ամպլիֆիկացիայի համար օգտագործվող ծավալներն են 20ուլ, 30ուլ և 50ուլլ: Կամ 100ուլ, թե ինչ ծավալ պետք է օգտագործվի ՊՇՌ ուժեղացման համար, սահմանվում է ըստ գիտական ​​հետազոտությունների և կլինիկական փորձարկման տարբեր նպատակների: Փոքր ծավալ պատրաստելուց հետո, օրինակ՝ 20ուլ, իսկ հետո ավելի մեծ ծավալ պատրաստելուց հետո պետք է հետևել պայմաններին, հակառակ դեպքում այն ​​հեշտությամբ կձախողվի։ Ֆիզիկական պատճառներ. Դենատուրացիան շատ կարևոր է PCR ամպլիֆիկացիայի համար: Եթե ​​դենատուրացիայի ջերմաստիճանը ցածր է, իսկ դենատուրացիայի ժամանակը կարճ է, ապա շատ հավանական է, որ տեղի ունենան կեղծ բացասականներ. եռացման ջերմաստիճանը չափազանց ցածր է, ինչը կարող է առաջացնել ոչ հատուկ ուժեղացում և նվազեցնել հատուկ ուժեղացման արդյունավետությունը: Հալման ջերմաստիճանը չափազանց բարձր է: Մեծապես ազդում է պրայմերների կաղապարներին կապելու վրա և նվազեցնում PCR ուժեղացման արդյունավետությունը: Երբեմն անհրաժեշտ է օգտագործել ստանդարտ ջերմաչափ՝ ուժեղացուցիչի կամ ջրում լուծվող կաթսայի դենատուրացիայի, կռելու և երկարացման ջերմաստիճանները ստուգելու համար: Սա նաև PCR-ի ձախողման պատճառներից մեկն է: Թիրախային հաջորդականության փոփոխություն. Եթե թիրախային հաջորդականությունը մուտացիայի է ենթարկվել կամ ջնջվել է, ինչը ազդում է այբբենարանի հատուկ կապակցման վրա կաղապարին, կամ այբբենարանն ու ձևանմուշը կորցնում են լրացուցիչ հաջորդականությունը՝ նպատակային հաջորդականության որոշակի հատվածի ջնջման պատճառով, PCR ուժեղացումը: հաջողություն չի ունենա.

2.կեղծ դրական ՊՇՌ ուժեղացման գոտին, որը հայտնվում է, համահունչ է թիրախային հաջորդականության շերտին, և երբեմն գոտին ավելի կանոնավոր և պայծառ է: Անհամապատասխան այբբենարանի ձևավորում. Ընտրված ուժեղացման հաջորդականությունը հոմոլոգիա ունի ոչ նպատակային ուժեղացման հաջորդականության հետ, ուստի PCR ուժեղացում կատարելիս ուժեղացված PCR արտադրանքը ոչ նպատակային հաջորդականություն է: Եթե ​​թիրախային հաջորդականությունը չափազանց կարճ է կամ այբբենարանը չափազանց կարճ է, ապա հեշտությամբ կարող են առաջանալ կեղծ դրական արդյունքներ: Այբբենարանները պետք է վերանախագծվեն: Թիրախային հաջորդականությունների կամ ուժեղացման արտադրանքների խաչաձև աղտոտում. Այս աղտոտման երկու պատճառ կա. Այս կեղծ դրականը կարող է լուծվել հետևյալ մեթոդներով. Եղեք զգույշ և նրբանկատորեն աշխատելիս, որպեսզի կանխեք թիրախային հաջորդականությունը նմուշառման ատրճանակի մեջ կամ դուրս շաղ տալ ցենտրիֆուգի խողովակից: Բացառությամբ ֆերմենտների և նյութերի, որոնք չեն կարող դիմակայել բարձր ջերմաստիճաններին, բոլոր ռեակտիվները կամ սարքավորումները պետք է ստերիլիզացվեն բարձր ճնշման միջոցով: Բոլոր ցենտրիֆուգային խողովակները և նմուշի ներարկման պիպետտի ծայրերը պետք է օգտագործվեն մեկ անգամ: Անհրաժեշտության դեպքում, ռեակցիայի խողովակները և ռեակտիվները ճառագայթվում են ուլտրամանուշակագույն լույսով, նախքան նմուշը ավելացնելը, որպեսզի ոչնչացնեն առկա նուկլեինաթթուները: Երկրորդը օդում նուկլեինաթթուների փոքր բեկորների աղտոտումն է։ Այս փոքր բեկորներն ավելի կարճ են, քան թիրախային հաջորդականությունը, բայց ունեն որոշակի հոմոոլոգիա։ Նրանք կարող են զուգակցվել միմյանց հետ, և պրայմերներին փոխլրացնելուց հետո PCR արտադրանքները կարող են ուժեղացվել, ինչը հանգեցնում է կեղծ դրական արդյունքների, որոնք կարող են կրճատվել կամ վերացվել ներկառուցված PCR մեթոդներով:

 

3. Հայտնվում են ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման գոտիներ Այն շերտերը, որոնք հայտնվում են PCR ուժեղացումից հետո, անհամապատասխան են ակնկալվող չափերին՝ ավելի մեծ կամ փոքր, կամ միաժամանակ հայտնվում են երկու հատուկ ուժեղացման գոտիները և ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման գոտիները: Ոչ սպեցիֆիկ շերտերի առաջացման պատճառներն են՝ նախ՝ այբբենարաններն ամբողջությամբ չեն փոխլրացնում թիրախային հաջորդականությունը, կամ այբբենարանները միավորվում են՝ ձևավորելով դիմերներ։ Երկրորդ պատճառն այն է, որ Mg2+ իոնների կոնցենտրացիան չափազանց բարձր է, եռացման ջերմաստիճանը չափազանց ցածր է, և PCR ցիկլերի քանակը չափազանց մեծ է: Երկրորդ գործոնը ֆերմենտի որակն ու քանակն է։ Որոշ աղբյուրների ֆերմենտները հաճախ հակված են ոչ սպեցիֆիկ շերտերի, բայց այլ աղբյուրների ֆերմենտները՝ ոչ: Ֆերմենտների չափազանց մեծ քանակությունը երբեմն կարող է հանգեցնել ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման: Հակազդող միջոցները ներառում են. անհրաժեշտության դեպքում վերանախագծել այբբենարաններ: Նվազեցրեք ֆերմենտի քանակը կամ փոխարինեք այն այլ աղբյուրով: Կրճատեք պրայմերների քանակը, համապատասխան կերպով ավելացրեք կաղապարի քանակը և կրճատեք ցիկլերի քանակը: Բարձրացրեք եփման ջերմաստիճանը պատշաճ կերպով կամ օգտագործեք երկջերմաստիճանի կետի մեթոդը (դենատուրացիա 93°C-ում, հալում և երկարացում մոտ 65°C):

 

4. Շերտավոր ձգում կամ քսուքներ են հայտնվում PCR ուժեղացումը երբեմն հայտնվում է որպես քսված ժապավեններ, թերթանման ժապավեններ կամ գորգի նման ժապավեններ: Պատճառները հաճախ պայմանավորված են ֆերմենտի չափից շատ կամ անորակ ֆերմենտի, dNTP-ի չափազանց բարձր կոնցենտրացիայի, շատ բարձր Mg2+ կոնցենտրացիայի, եռացման չափազանց ցածր ջերմաստիճանի և չափազանց շատ ցիկլերի պատճառով: Հակազդող միջոցները ներառում են. ① Կրճատել ֆերմենտի քանակը կամ փոխարինել ֆերմենտը այլ աղբյուրով: ②Նվազեցրեք dNTP-ի կոնցենտրացիան: Համապատասխանաբար նվազեցնել Mg2+ կոնցենտրացիան: Բարձրացրեք կաղապարների քանակը և կրճատեք ցիկլերի քանակը