PCR GYIK 1. Hamis negatív, nem jelenik meg amplifikációs sáv 2. Hamis pozitív 3. Nem specifikus amplifikációs sávok jelennek meg 4. Foltos húzócsíkok vagy kenetcsíkok jelennek meg:
1 Hamis negatív, nem jelenik meg amplifikált sáv A PCR reakció kulcsfontosságú szempontjai a következők
① templát nukleinsav előállítása
② primer minősége és specifikussága
③ enzimminőség és
④ PCR ciklus feltételei. Az okok felderítéséhez a fenti linkeken is érdemes elemzést és kutatást végezni.
Sablon:
① A templát szennyező fehérjéket tartalmaz
② A sablon Taq enzim inhibitorokat tartalmaz
③ A templátban lévő fehérjék nem emésztődnek meg és nem távolíthatók el, különösen a kromoszómák hisztonjai
④ Túl sok veszett a sablon extrahálása és előkészítése során, vagy fenolt lélegeztek be
⑤A templát nukleinsav nincs teljesen denaturálva. Ha az enzimek és primerek minősége jó, ha nem jelennek meg amplifikációs sávok, akkor nagy valószínűséggel a minta emésztési folyamatában vagy a templát nukleinsav extrakciós folyamatában van valami hiba. Ezért hatékony és stabil emésztőoldatot kell készíteni, és az eljárást rögzíteni kell, és nem szabad tetszőlegesen megváltoztatni. . Enzim inaktiválás: Szükséges az új enzim cseréje, vagy a régi és az új enzimek egyidejű alkalmazása annak elemzésére, hogy az álnegatívumot az enzim elvesztése vagy elégtelen aktivitása okozza-e. Meg kell jegyezni, hogy néha elfelejtik a Taq enzimet. Primerek: A primer minősége, a primer koncentrációja és az, hogy a két primer koncentrációja szimmetrikus-e, gyakori oka a PCR sikertelenségének vagy a nem kielégítő amplifikációs sávoknak és a könnyű diffúziónak. Egyes tételekben problémák vannak a primer szintézis minőségével. A két primer közül az egyik magas, a másik alacsony koncentrációjú, ami alacsony hatásfokú aszimmetrikus amplifikációt eredményez.
Az ellenintézkedések a következők:
① Válasszon egy jó primer szintézis egységet.
② A primerek koncentrációja során nem csak az OD-értéket kell figyelembe venni, hanem az agaróz gélelektroforézishez használt primer törzsoldatot is. Alapozó sávoknak kell lenniük, és a két alapozó sáv fényerejének nagyjából azonosnak kell lennie. Például az egyik primernek van egy sávja, a másik primernek nincs sávja. A csíkok esetében a PCR jelenleg sikertelen lehet, és a primer szintézis egységgel való egyeztetés útján kell megoldani. Ha az egyik alapozónak nagy a fényessége, a másiknak alacsony a fényessége, egyensúlyozza ki a koncentrációkat az alapozók hígítása során.
③ Az alapozókat nagy koncentrációban és kis mennyiségben kell tárolni, hogy elkerüljük az ismételt fagyást és felengedést, illetve a hosszú távú hűtőszekrényben való tárolást, ami az alapozók károsodásához és lebomlásához vezethet.
④A primer kialakítása indokolatlan, például a primer hossza nem elegendő, a primerek között dimerek képződnek, stb. Mg2+ koncentráció: A Mg2+ ion koncentráció nagyban befolyásolja a PCR amplifikáció hatékonyságát. Ha a koncentráció túl magas, az csökkentheti a PCR-amplifikáció specificitását. Ha a koncentráció túl alacsony, az befolyásolja a PCR amplifikációs hozamot, és még azt is okozhatja, hogy a PCR amplifikáció meghiúsul amplifikációs sávok nélkül. Változások a reakciótérfogatban: Általában a PCR-amplifikációhoz használt térfogatok 20 ul, 30 ul és 50 ul. Vagy 100 ul, hogy a PCR amplifikációhoz milyen térfogatot kell használni, azt a tudományos kutatás és a klinikai tesztelés különböző céljai szerint állítják be. Kis mennyiség, például 20 ul, majd nagyobb térfogat készítése után be kell tartania a feltételeket, különben könnyen meghibásodik. Fizikai okok: A denaturáció nagyon fontos a PCR amplifikációhoz. Ha a denaturálási hőmérséklet alacsony és a denaturációs idő rövid, nagy valószínűséggel hamis negatívok fordulnak elő; a lágyítási hőmérséklet túl alacsony, ami nem specifikus erősítést okozhat, és csökkenti a fajlagos erősítés hatékonyságát. Az izzítási hőmérséklet túl magas. Erősen befolyásolja a primerek kötődését a templátokhoz, és csökkenti a PCR amplifikáció hatékonyságát. Néha szabványos hőmérővel kell ellenőrizni a denaturációs, lágyítási és kiterjesztési hőmérsékletet az erősítőben vagy a vízoldható edényben. Ez is az egyik oka a PCR sikertelenségének. Célszekvencia variáció: Ha a célszekvencia mutációja vagy deléciója, ami befolyásolja a primer specifikus kötődését a templáthoz, vagy a primer és a templát elveszti a komplementer szekvenciát a célszekvencia egy bizonyos szegmensének deléciója miatt, a PCR amplifikáció nem lesz sikeres.
2. téves pozitív A megjelenő PCR amplifikációs sáv összhangban van a célszekvencia sávjával, és néha a sáv rendezettebb és világosabb. Nem megfelelő primer tervezés: A kiválasztott amplifikációs szekvencia homológiát mutat a nem cél amplifikációs szekvenciával, így a PCR amplifikáció végrehajtásakor az amplifikált PCR termék nem célszekvencia. Ha a célszekvencia túl rövid, vagy a primer túl rövid, könnyen előfordulhat téves pozitív eredmény. Az alapozókat újra kell tervezni. Célszekvenciák vagy amplifikációs termékek keresztszennyeződése: Ennek a szennyeződésnek két oka van: Először is, a teljes genom vagy nagy fragmentumok keresztszennyeződése, ami téves pozitív eredményekhez vezet. Ez a téves pozitív eredmény a következő módszerekkel oldható meg: Legyen óvatos és kíméletes a művelet során, nehogy a célszekvencia beszívódjon a mintapisztolyba vagy kifröccsenjen a centrifugacsőből. Az enzimek és a magas hőmérsékletnek nem ellenálló anyagok kivételével minden reagenst vagy berendezést nagy nyomással kell sterilizálni. Minden centrifugacsövet és mintainjekciós pipettahegyet egyszer fel kell használni. Szükség esetén a reakciócsöveket és a reagenseket ultraibolya fénnyel sugározzák be a minta hozzáadása előtt, hogy elpusztítsák a jelenlévő nukleinsavakat. A második a levegőben lévő kis nukleinsav-fragmensek szennyeződése. Ezek a kis fragmentumok rövidebbek, mint a célszekvencia, de bizonyos homológiát mutatnak. Ezek egymáshoz illeszthetők, majd a primerekkel komplementer PCR-termékek amplifikálhatók, téves pozitív eredményeket eredményezve, amelyek egymásba ágyazott PCR módszerekkel csökkenthetők vagy kiküszöbölhetők.
3.Nem specifikus amplifikációs sávok jelennek meg A PCR amplifikáció után megjelenő sávok nem konzisztensek a várt mérettel, akár nagyobbak, akár kisebbek, vagy a specifikus amplifikációs sávok és a nem specifikus amplifikációs sávok egyszerre jelennek meg. A nem specifikus sávok megjelenésének okai a következők: először is, a primerek nem teljesen komplementerek a célszekvenciával, vagy a primerek aggregálódnak dimerekké. A második ok az, hogy túl magas a Mg2+ ion koncentrációja, túl alacsony a lágyítási hőmérséklet, és túl magas a PCR ciklusok száma. A második tényező az enzim minősége és mennyisége. Az egyes forrásokból származó enzimek gyakran hajlamosak a nem specifikus sávokra, de a más forrásokból származó enzimek nem. Az enzimek túlzott mennyisége néha nem specifikus amplifikációhoz vezethet. Az ellenintézkedések közé tartozik: szükség esetén az alapozók újratervezése. Csökkentse az enzim mennyiségét, vagy cserélje ki más forrással. Csökkentse a primerek mennyiségét, növelje megfelelően a sablon mennyiségét, és csökkentse a ciklusok számát. Növelje megfelelően az izzítási hőmérsékletet, vagy használja a kéthőmérsékletpontos módszert (denaturálás 93 °C-on, lágyítás és nyújtás 65 °C körül).
4. Pelyhes húzódás vagy foltok jelennek meg. A PCR-amplifikáció néha elkenődött sávokként, lapszerű sávokként vagy szőnyegszerű csíkokként jelenik meg. Az okokat gyakran a túl sok enzim vagy az enzim rossz minősége, a túl magas dNTP-koncentráció, a túl magas Mg2+-koncentráció, a túl alacsony hőkezelési hőmérséklet és a túl sok ciklus okozza. Az ellenintézkedések a következők: ① Csökkentse az enzim mennyiségét, vagy cserélje ki az enzimet más forrással. ② Csökkentse a dNTP koncentrációját. Csökkentse megfelelően a Mg2+ koncentrációt. Növelje a sablonok számát és csökkentse a ciklusok számát
