Odvajanje i pročišćavanje proteina naširoko se koristi u biokemijskim istraživanjima i primjenama te je važna operativna vještina. Tipična eukariotska stanica može sadržavati tisuće različitih proteina, neki su vrlo bogati, a neki sadrže samo nekoliko kopija. Kako bi se proučio određeniprotein, potrebno je prvo pročistiti protein od ostalih proteina i neproteinskih molekula.

1. Metoda soljenjaprotein:

Neutralna sol ima značajan utjecaj na topljivost proteina. Općenito, s povećanjem koncentracije soli pod niskom koncentracijom soli, povećava se topljivost proteina. To se zove soljenje; kada koncentracija soli nastavi rasti, topljivost proteina se smanjuje u različitim stupnjevima i odvajaju se jedan za drugim. Taj se fenomen naziva isoljavanje.

2. Metoda slaganja izoelektričnih točaka:

Elektrostatsko odbijanje između čestica je najmanje kada je protein statičan, pa je i topljivost najmanja. Izoelektrične točke različitih proteina su različite. pH otopine za kondicioniranje može se koristiti za postizanje izoelektrične točke proteina kako bi se nakupio, ali ova se metoda rijetko koristi sama i može se kombinirati s metodom isoljavanja.

3.Dijaliza i ultrafiltracija:

Dijaliza koristi polupropusnu membranu za odvajanje proteina različitih veličina molekula. Metoda ultrafiltracije koristi visoki tlak ili centrifugalnu silu kako bi voda i druge male molekule otopljene tvari prošle kroz polupropusnu membranu, dokproteinostaje na membrani. Možete odabrati različite veličine pora za presretanje proteina različitih molekularnih težina.

4. Metoda gel filtracije:

Također se naziva kromatografija isključenja veličine ili kromatografija molekularnog sita, ovo je jedna od najkorisnijih metoda za odvajanje proteinskih smjesa prema veličini molekule. Češće korišteni materijali za pakiranje u koloni su glukozni gel (Sephadex ged) i agarozni gel (agarose gel).

5. Elektroforeza:

Pod istim pH uvjetima, različiti proteini mogu se odvojiti zbog njihove različite molekulske težine i različitih naboja u električnom polju. Vrijedno je obratiti pozornost na elektroforezu s izoelektričnim setom, koja koristi amfolit kao nosač. Tijekom elektroforeze, amfolit stvara pH gradijent koji se postupno dodaje od pozitivne elektrode prema negativnoj elektrodi. Kada protein s određenim nabojem pliva u njemu, doći će jedan do drugog. pH položaj električne točke je diskontinuiran, a ova se metoda može koristiti za analizu i pripremu različitih proteina.

6. Ionska komunikacijska kromatografija:

ionska komunikacijska sredstva uključuju kationska komunikacijska sredstva (kao što je karboksimetil celuloza; CM-celuloza) i anionska komunikacijska sredstva (dietilaminoetil celuloza). Pri prolasku kroz kolonu ionske komunikacijske kromatografije, protein sa suprotnim nabojem od ionskog komunikacijskog sredstva adsorbira se na ionskom komunikacijskom sredstvu, a zatim se adsorbiraproteineluira se promjenom pH ili ionske jakosti.

7. Afinitetna kromatografija:

Afinitetna kromatografija iznimno je korisna metoda za odvajanje proteina. Često je potreban samo jedan korak za odvajanje određenog proteina koji se treba pročistiti od neuredne proteinske smjese visoke čistoće.

Ova se metoda temelji na specifičnom, a ne na kovalentnom vezanju određenih proteina na drugu molekulu koja se naziva ligand (Ligand).

Osnovno načelo:

proteini postoje u neurednoj smjesi u tkivima ili stanicama, a svaka vrsta stanice sadrži tisuće različitih proteina. Stoga je razlika između proteina važan dio biokemije i nije sama. Ili skup gotovih metoda može ukloniti bilo koju vrstu proteina iz neuredno miješanih proteina, tako da se nekoliko metoda često koristi u kombinaciji.