प्रोटीन का पृथक्करण और शुद्धिकरण जैव रसायन अनुसंधान और अनुप्रयोग में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और यह एक महत्वपूर्ण परिचालन कौशल है। एक विशिष्ट यूकेरियोटिक कोशिका में हजारों विभिन्न प्रोटीन हो सकते हैं, कुछ बहुत समृद्ध होते हैं और कुछ में केवल कुछ प्रतियां होती हैं। एक निश्चित अध्ययन करने के लिएप्रोटीन, सबसे पहले प्रोटीन को अन्य प्रोटीन और गैर-प्रोटीन अणुओं से शुद्ध करना आवश्यक है।

1. नमकीन बनाने की विधिप्रोटीन:

तटस्थ नमक प्रोटीन की घुलनशीलता पर महत्वपूर्ण प्रभाव डालता है। आम तौर पर, कम नमक सांद्रता के तहत नमक सांद्रता में वृद्धि के साथ, प्रोटीन की घुलनशीलता बढ़ जाती है। इसे नमकीन बनाना कहते हैं; जब नमक की सांद्रता बढ़ती रहती है, तो प्रोटीन की घुलनशीलता अलग-अलग डिग्री तक कम हो जाती है और एक के बाद एक अलग हो जाती है। इस घटना को साल्टिंग आउट कहा जाता है।

2. आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट स्टैकिंग विधि:

जब प्रोटीन स्थिर होता है तो कणों के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण सबसे छोटा होता है, इसलिए घुलनशीलता भी सबसे छोटी होती है। विभिन्न प्रोटीनों के आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु अलग-अलग होते हैं। कंडीशनिंग समाधान के पीएच का उपयोग प्रोटीन के आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु तक पहुंचने के लिए किया जा सकता है, इसे जमा किया जा सकता है, लेकिन इस विधि का उपयोग शायद ही कभी अकेले किया जाता है और इसे सॉल्टिंग-आउट विधि के साथ जोड़ा जा सकता है।

3.डायलिसिस और अल्ट्राफिल्ट्रेशन:

डायलिसिस विभिन्न आणविक आकारों के प्रोटीन को अलग करने के लिए एक अर्ध-पारगम्य झिल्ली का उपयोग करता है। अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधि पानी और अन्य छोटे विलेय अणुओं को अर्ध-पारगम्य झिल्ली से गुजारने के लिए उच्च दबाव या केन्द्रापसारक बल का उपयोग करती है, जबकिप्रोटीनझिल्ली पर रहता है. आप अलग-अलग आणविक भार के प्रोटीन को रोकने के लिए अलग-अलग छिद्र आकार चुन सकते हैं।

4.जेल निस्पंदन विधि:

इसे आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी या आणविक चलनी क्रोमैटोग्राफी भी कहा जाता है, यह आणविक आकार के अनुसार प्रोटीन मिश्रण को अलग करने के लिए सबसे उपयोगी तरीकों में से एक है। कॉलम में आमतौर पर उपयोग की जाने वाली पैकिंग सामग्री ग्लूकोज जेल (सेफैडेक्स जीईडी) और एगरोज़ जेल (एगरोज़ जेल) हैं।

5. वैद्युतकणसंचलन:

एक ही पीएच स्थिति के तहत, विभिन्न प्रोटीनों को उनके विभिन्न आणविक भार और विद्युत क्षेत्र में विभिन्न आवेशों के कारण अलग किया जा सकता है। यह आइसोइलेक्ट्रिक सेट इलेक्ट्रोफोरेसिस पर ध्यान देने योग्य है, जो एक वाहक के रूप में एम्फोलाइट का उपयोग करता है। वैद्युतकणसंचलन के दौरान, एम्फोलाइट एक पीएच ग्रेडिएंट बनाता है जो धीरे-धीरे सकारात्मक इलेक्ट्रोड से नकारात्मक इलेक्ट्रोड में जुड़ जाता है। जब एक निश्चित आवेश वाला प्रोटीन इसमें तैरता है, तो यह एक दूसरे तक पहुंच जाएगा। विद्युत बिंदु की पीएच स्थिति असंतत है, और इस विधि का उपयोग विभिन्न प्रोटीनों का विश्लेषण और तैयार करने के लिए किया जा सकता है।

6. आयन संचार क्रोमैटोग्राफी:

आयन संचार एजेंटों में धनायनित संचार एजेंट (जैसे कार्बोक्सिमिथाइल सेलूलोज़; सीएम-सेलूलोज़) और आयनिक संचार एजेंट (डायथाइलामिनोइथाइल सेलुलोज़) शामिल हैं। आयन संचार क्रोमैटोग्राफी कॉलम से गुजरते समय, आयन संचार एजेंट के विपरीत चार्ज वाला प्रोटीन आयन संचार एजेंट पर सोख लिया जाता है, और फिर सोख लिया जाता हैप्रोटीनपीएच या आयनिक शक्ति को बदलकर इसे शांत किया जाता है।

7.एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी:

प्रोटीन को अलग करने के लिए एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी एक अत्यंत उपयोगी विधि है। उच्च शुद्धता वाले गंदे प्रोटीन मिश्रण से शुद्ध होने के लिए एक निश्चित प्रोटीन को अलग करने के लिए अक्सर केवल एक चरण की आवश्यकता होती है।

यह विधि कुछ प्रोटीनों के सहसंयोजक के बजाय विशिष्ट बंधन पर एक अन्य अणु जिसे लिगैंड (लिगैंड) कहा जाता है, पर आधारित है।

मूल सिद्धांत:

प्रोटीन ऊतकों या कोशिकाओं में एक गंदे मिश्रण में मौजूद होते हैं, और प्रत्येक प्रकार की कोशिका में हजारों अलग-अलग प्रोटीन होते हैं। इसलिए, प्रोटीन के बीच अंतर जैव रसायन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है, और यह अकेला नहीं रहा है। या तैयार तरीकों का एक सेट गंदे मिश्रित प्रोटीन से किसी भी प्रकार के प्रोटीन को हटा सकता है, इसलिए कई तरीकों को अक्सर संयोजन में उपयोग किया जाता है।