पीसीआर FAQ 1. गलत नकारात्मक, कोई प्रवर्धन बैंड दिखाई नहीं देता 2. गलत सकारात्मक 3. गैर-विशिष्ट प्रवर्धन बैंड दिखाई देते हैं 4. परतदार ड्रैग स्ट्रिप्स या स्मीयर स्ट्रिप्स दिखाई देते हैं：

1गलत नकारात्मक, कोई प्रवर्धित बैंड प्रकट नहीं होता है पीसीआर प्रतिक्रिया के प्रमुख पहलू हैं

① टेम्पलेट न्यूक्लिक एसिड की तैयारी

② प्राइमर गुणवत्ता और विशिष्टता

③ एंजाइम गुणवत्ता और

④ पीसीआर चक्र की स्थिति। कारणों का पता लगाने के लिए उपरोक्त लिंक्स पर भी विश्लेषण एवं शोध किया जाना चाहिए।

टेम्पलेट:

① टेम्पलेट में अशुद्धता प्रोटीन शामिल है

② टेम्पलेट में Taq एंजाइम अवरोधक शामिल हैं

③ टेम्पलेट में प्रोटीन पचते और हटाए नहीं जाते, विशेषकर गुणसूत्रों में हिस्टोन

④ टेम्प्लेट के निष्कर्षण और तैयारी के दौरान बहुत अधिक मात्रा खो गई थी, या फिनोल साँस के माध्यम से अंदर चला गया था

⑤टेम्पलेट न्यूक्लिक एसिड पूरी तरह से विकृत नहीं है। जब एंजाइमों और प्राइमरों की गुणवत्ता अच्छी होती है, यदि प्रवर्धन बैंड दिखाई नहीं देते हैं, तो यह सबसे अधिक संभावना है कि नमूने की पाचन प्रक्रिया या टेम्पलेट न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण प्रक्रिया में कुछ गड़बड़ है। इसलिए, एक प्रभावी और स्थिर पाचन समाधान तैयार किया जाना चाहिए, और प्रक्रिया को ठीक किया जाना चाहिए और इच्छानुसार बदलाव नहीं किया जाना चाहिए। . एंजाइम निष्क्रियता: यह विश्लेषण करने के लिए कि क्या झूठी नकारात्मक हानि या अपर्याप्त एंजाइम गतिविधि के कारण होती है, नए एंजाइम को प्रतिस्थापित करना या एक ही समय में पुराने और नए दोनों एंजाइमों का उपयोग करना आवश्यक है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कभी-कभी टाक एंजाइम को भुला दिया जाता है। प्राइमर: प्राइमर गुणवत्ता, प्राइमर एकाग्रता, और क्या दो प्राइमरों की सांद्रता सममित है, पीसीआर विफलता या असंतोषजनक प्रवर्धन बैंड और आसान प्रसार के सामान्य कारण हैं। कुछ बैचों में प्राइमर संश्लेषण की गुणवत्ता में समस्याएँ हैं। दो प्राइमरों में से एक में उच्च सांद्रता होती है और दूसरे में कम सांद्रता होती है, जिसके परिणामस्वरूप कम दक्षता वाला असममित प्रवर्धन होता है।

जवाबी उपाय हैं:

① एक अच्छी प्राइमर संश्लेषण इकाई का चयन करें।

② प्राइमर की सांद्रता को न केवल OD मान पर ध्यान देना चाहिए, बल्कि agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए प्राइमर स्टॉक समाधान पर भी ध्यान देना चाहिए। प्राइमर बैंड होने चाहिए और दोनों प्राइमर बैंड की चमक लगभग समान होनी चाहिए। उदाहरण के लिए, एक प्राइमर में एक बैंड होता है और दूसरे प्राइमर में कोई बैंड नहीं होता है। स्ट्रिप्स के लिए, पीसीआर इस समय विफल हो सकता है और इसे प्राइमर संश्लेषण इकाई के साथ बातचीत के माध्यम से हल किया जाना चाहिए। यदि एक प्राइमर में उच्च चमक है और दूसरे में कम चमक है, तो प्राइमर को पतला करते समय सांद्रता को संतुलित करें।

③ बार-बार जमने और पिघलने या रेफ्रिजरेटर में लंबे समय तक भंडारण को रोकने के लिए प्राइमर को उच्च सांद्रता और छोटी मात्रा में संग्रहित किया जाना चाहिए, जिससे प्राइमर खराब हो सकते हैं और ख़राब हो सकते हैं।

④प्राइमर का डिज़ाइन अनुचित है, जैसे कि प्राइमर की लंबाई पर्याप्त नहीं है, प्राइमरों के बीच डिमर बनते हैं, आदि। Mg2+ सांद्रता: Mg2+ आयन सांद्रता का पीसीआर प्रवर्धन दक्षता पर बहुत प्रभाव पड़ता है। यदि सांद्रता बहुत अधिक है, तो यह पीसीआर प्रवर्धन की विशिष्टता को कम कर सकता है। यदि सांद्रता बहुत कम है, तो यह पीसीआर प्रवर्धन उपज को प्रभावित करेगा और यहां तक ​​कि प्रवर्धित बैंड के बिना पीसीआर प्रवर्धन विफल हो जाएगा। प्रतिक्रिया मात्रा में परिवर्तन: आमतौर पर पीसीआर प्रवर्धन के लिए उपयोग की जाने वाली मात्रा 20ul, 30ul और 50ul होती है। या 100ul, पीसीआर प्रवर्धन के लिए किस मात्रा का उपयोग किया जाना चाहिए, यह वैज्ञानिक अनुसंधान और नैदानिक ​​​​परीक्षण के विभिन्न उद्देश्यों के अनुसार निर्धारित किया जाता है। एक छोटी मात्रा बनाने के बाद, जैसे कि 20ul, और फिर एक बड़ी मात्रा बनाने के बाद, आपको शर्तों का पालन करना होगा, अन्यथा यह आसानी से विफल हो जाएगा। भौतिक कारण: पीसीआर प्रवर्धन के लिए विकृतीकरण बहुत महत्वपूर्ण है। यदि विकृतीकरण तापमान कम है और विकृतीकरण का समय कम है, तो गलत नकारात्मक परिणाम होने की बहुत संभावना है; एनीलिंग तापमान बहुत कम है, जो गैर-विशिष्ट प्रवर्धन का कारण बन सकता है और विशिष्ट प्रवर्धन दक्षता को कम कर सकता है। एनीलिंग तापमान बहुत अधिक है. प्राइमर को टेम्प्लेट से जोड़ने को अत्यधिक प्रभावित करता है और पीसीआर प्रवर्धन दक्षता को कम करता है। कभी-कभी एम्पलीफायर या पानी में घुलनशील पॉट में विकृतीकरण, एनीलिंग और विस्तार तापमान की जांच के लिए एक मानक थर्मामीटर का उपयोग करना आवश्यक होता है। पीसीआर फेल होने का एक कारण यह भी है. लक्ष्य अनुक्रम भिन्नता: यदि लक्ष्य अनुक्रम को उत्परिवर्तित या हटा दिया जाता है, जो टेम्पलेट के साथ प्राइमर की विशिष्ट बाइंडिंग को प्रभावित करता है, या लक्ष्य अनुक्रम के एक निश्चित खंड को हटाने के कारण प्राइमर और टेम्पलेट पूरक अनुक्रम खो देते हैं, तो पीसीआर प्रवर्धन सफल नहीं होगा.

2. गलत सकारात्मक दिखाई देने वाला पीसीआर प्रवर्धन बैंड लक्ष्य अनुक्रम बैंड के अनुरूप है, और कभी-कभी बैंड अधिक व्यवस्थित और उज्जवल होता है। अनुचित प्राइमर डिज़ाइन: चयनित प्रवर्धन अनुक्रम में गैर-लक्ष्य प्रवर्धन अनुक्रम के साथ समरूपता होती है, इसलिए पीसीआर प्रवर्धन करते समय, प्रवर्धित पीसीआर उत्पाद एक गैर-लक्ष्य अनुक्रम होता है। यदि लक्ष्य अनुक्रम बहुत छोटा है या प्राइमर बहुत छोटा है, तो गलत सकारात्मकता आसानी से उत्पन्न हो सकती है। प्राइमरों को फिर से डिज़ाइन करने की आवश्यकता है। लक्ष्य अनुक्रमों या प्रवर्धन उत्पादों का क्रॉस-संदूषण: इस संदूषण के दो कारण हैं: पहला, संपूर्ण जीनोम या बड़े टुकड़ों का क्रॉस-संदूषण, जिससे झूठी सकारात्मकता उत्पन्न होती है। इस गलत सकारात्मकता को निम्नलिखित तरीकों से हल किया जा सकता है: लक्ष्य अनुक्रम को नमूना बंदूक में सोखने या सेंट्रीफ्यूज ट्यूब से बाहर निकलने से रोकने के लिए संचालन करते समय सावधान और सौम्य रहें। उन एंजाइमों और पदार्थों को छोड़कर जो उच्च तापमान का सामना नहीं कर सकते, सभी अभिकर्मकों या उपकरणों को उच्च दबाव द्वारा निष्फल किया जाना चाहिए। सभी सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और सैंपल इंजेक्शन पिपेट टिप का एक बार उपयोग किया जाना चाहिए। यदि आवश्यक हो, तो मौजूद न्यूक्लिक एसिड को नष्ट करने के लिए नमूना जोड़ने से पहले प्रतिक्रिया ट्यूबों और अभिकर्मकों को पराबैंगनी प्रकाश से विकिरणित किया जाता है। दूसरा है हवा में न्यूक्लिक एसिड के छोटे टुकड़ों का संदूषण। ये छोटे टुकड़े लक्ष्य अनुक्रम से छोटे हैं, लेकिन इनमें कुछ निश्चित समरूपता है। उन्हें एक-दूसरे से जोड़ा जा सकता है, और प्राइमरों के पूरक होने के बाद, पीसीआर उत्पादों को बढ़ाया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप झूठी सकारात्मकता उत्पन्न होती है, जिसे नेस्टेड पीसीआर तरीकों से कम या समाप्त किया जा सकता है।

 

3. गैर-विशिष्ट प्रवर्धन बैंड दिखाई देते हैं पीसीआर प्रवर्धन के बाद दिखाई देने वाले बैंड अपेक्षित आकार के साथ असंगत होते हैं, या तो बड़े या छोटे, या दोनों विशिष्ट प्रवर्धन बैंड और गैर-विशिष्ट प्रवर्धन बैंड एक ही समय में दिखाई देते हैं। गैर-विशिष्ट बैंड की उपस्थिति के कारण हैं: सबसे पहले, प्राइमर लक्ष्य अनुक्रम के लिए पूरी तरह से पूरक नहीं हैं, या प्राइमर एकत्रित होकर डिमर बनाते हैं। दूसरा कारण यह है कि Mg2+ आयन सांद्रता बहुत अधिक है, एनीलिंग तापमान बहुत कम है, और पीसीआर चक्रों की संख्या बहुत अधिक है। दूसरा कारक एंजाइम की गुणवत्ता और मात्रा है। कुछ स्रोतों के एंजाइम अक्सर गैर-विशिष्ट बैंड के प्रति प्रवण होते हैं लेकिन अन्य स्रोतों के एंजाइम ऐसा नहीं करते हैं। एंजाइमों की अत्यधिक मात्रा कभी-कभी गैर-विशिष्ट प्रवर्धन का कारण बन सकती है। जवाबी उपायों में शामिल हैं: यदि आवश्यक हो तो प्राइमरों को फिर से डिज़ाइन करें। एंजाइम की मात्रा कम करें या इसे किसी अन्य स्रोत से बदलें। प्राइमर की मात्रा कम करें, टेम्पलेट की मात्रा उचित रूप से बढ़ाएं और चक्रों की संख्या कम करें। एनीलिंग तापमान को उचित रूप से बढ़ाएं या दो-तापमान बिंदु विधि (93 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण, एनीलिंग और 65 डिग्री सेल्सियस के आसपास विस्तार) का उपयोग करें।

 

4. परतदार खिंचाव या धब्बा दिखाई देता है पीसीआर प्रवर्धन कभी-कभी धब्बादार बैंड, शीट-जैसे बैंड या कालीन-जैसे बैंड के रूप में दिखाई देता है। इसका कारण अक्सर बहुत अधिक एंजाइम या एंजाइम की खराब गुणवत्ता, बहुत अधिक dNTP सांद्रता, बहुत अधिक Mg2+ सांद्रता, बहुत कम एनीलिंग तापमान और बहुत अधिक चक्र होते हैं। प्रति-उपायों में शामिल हैं: ① एंजाइम की मात्रा कम करें, या एंजाइम को किसी अन्य स्रोत से बदलें। ②dNTP की सांद्रता कम करें। Mg2+ सांद्रता को उचित रूप से कम करें। टेम्प्लेट की संख्या बढ़ाएँ और चक्रों की संख्या कम करें