PCR FAQ 1. ʻAʻole hoʻopunipuni, ʻaʻohe pūna hoʻonui i ʻike ʻia 2. ʻAʻohe maikaʻi 3. Hōʻike ʻia nā pūʻulu hoʻonui ʻole kikoʻī 4. Hōʻike ʻia nā ʻāpana huki palaki a i ʻole nā ​​ʻāpana smear:

1 ʻAʻohe hewa hewa, ʻaʻohe mea i hoʻonui ʻia ʻO nā mea nui o ka hopena PCR

① hoʻomākaukau i ka ʻakika nucleic template

② ka maikaʻi a me ka kikoʻī

③ ka maikaʻi o ka enzyme a

④ kūlana pōʻai PCR. No ka ʻike ʻana i nā kumu, pono e hana ʻia ka loiloi a me ka noiʻi ma nā loulou i luna.

Papahana:

① Aia i loko o ka laʻana nā protein haumia

② Aia i loko o ka la'ana nā mea ho'okolo o ka enzyme Taq

③ ʻAʻole ʻeli ʻia a wehe ʻia nā protein o ka template, ʻoi aku ka nui o nā histones i loko o nā chromosomes.

④ Nui loa ka mea i nalowale i ka wā o ka unuhi ʻana a me ka hoʻomākaukau ʻana o ka template, a i ʻole ka phenol i inhaled

⑤ʻAʻole i hoʻopau loa ʻia ka waikawa nucleic template. Ke maikaʻi ka maikaʻi o nā enzymes a me nā primers, inā ʻaʻole ʻike ʻia nā kaula hoʻonui, aia paha kekahi hewa i ke kaʻina hana hoʻoheheʻe ʻana o ka specimen a i ʻole ke kaʻina hana hoʻoheheʻe nucleic acid. No laila, pono e hoʻomākaukau i kahi hoʻonā hoʻoheheʻe kūpono a paʻa, a pono e hoʻopaʻa ʻia ke kaʻina hana a ʻaʻole pono e hoʻololi ʻia ma ka makemake. . Enzyme inactivation: Pono e hoʻololi i ka enzyme hou, a i ʻole e hoʻohana i nā enzyme kahiko a me nā enzyme hou i ka manawa like no ka nānā ʻana i ka hopena o nā hewa hewa ma muli o ka nalowale a i ʻole ka lawa ʻole o ka hana enzyme. Pono e hoʻomaopopo ʻia i kekahi manawa ua poina ʻia ka enzyme Taq. Nā kumu: ʻO ka maikaʻi o ke kumu, ka ʻike kumu mua, a inā paha he symmetrical nā kumu o nā primers ʻelua he mau kumu maʻamau o ka PCR hemahema a i ʻole ka maikaʻi ʻole o ka amplification band a me ka maʻalahi diffusion. Aia nā pilikia me ka maikaʻi o ka synthesis primer i kekahi mau pūʻulu. ʻO kekahi o nā kumu mua ʻelua he koʻikoʻi kiʻekiʻe a ʻo kekahi he haʻahaʻa haʻahaʻa, e hopena i ka haʻahaʻa haʻahaʻa asymmetric amplification.

ʻO nā mea hoʻoponopono:

① E koho i kahi ʻāpana synthesis mua maikaʻi.

② ʻAʻole pono ka nānā ʻana o nā kumu mua i ka waiwai OD, akā e hoʻolohe pū i ka hopena waiwai kumu no ka electrophoresis gel agarose. Pono e loaʻa nā pūʻulu mua, a ʻo ka ʻōlinolino o nā pūʻulu kumu ʻelua e like like. No ka laʻana, loaʻa i kahi puʻupuʻu kahi pūʻulu a ʻaʻohe puʻupuʻu ʻē aʻe. No nā paʻi, hiki ke hāʻule ka PCR i kēia manawa a pono e hoʻoholo ʻia ma o ke kūkākūkā ʻana me ka ʻāpana synthesis primer. Inā loaʻa ka ʻōlinolino kiʻekiʻe o kekahi kumu mua a haʻahaʻa ka ʻōlinolino ʻē aʻe, e kaulike i nā manaʻo i ka wā e hoʻoheheʻe ai i nā primers.

③ Pono e hoʻopaʻa ʻia nā primers i loko o ka manaʻo kiʻekiʻe a me nā mea liʻiliʻi e pale ai i ka maloʻo mau a me ka hoʻoheheʻe ʻana a i ʻole ka mālama lōʻihi ʻana i loko o ka friji, hiki ke alakaʻi i ka pōʻino a me ka hōʻino ʻana o nā primers.

④ ʻAʻole kūpono ka hoʻolālā kumu, e like me ka lawa ʻole o ka lōʻihi o ka primer, ua hoʻokumu ʻia nā dimer ma waena o nā primers, a pēlā aku. Inā kiʻekiʻe loa ka manaʻo, hiki iā ia ke hōʻemi i ka kikoʻī o ka PCR amplification. Inā haʻahaʻa loa ka manaʻo, pili ia i ka hoʻonui ʻana i ka PCR amplification yield a hiki ke hoʻopau i ka PCR amplification me ka ʻole o ka hoʻonui ʻana i nā kaula. Hoʻololi i ka leo pane: ʻO ka maʻamau o nā puke i hoʻohana ʻia no ka hoʻonui PCR he 20ul, 30ul, a me 50ul. A i ʻole 100ul, he aha ka leo e hoʻohana ʻia no ka PCR amplification i hoʻonohonoho ʻia e like me nā kumu like ʻole o ka noiʻi ʻepekema a me nā hoʻokolohua lapaʻau. Ma hope o ka hanaʻana i kahi leo liʻiliʻi, e like me 20ul, a laila e hana i ka leo nui, ponoʻoe e hahai i nā kūlana, iʻole e maʻalahi ka hāʻule. Nā kumu kino: He mea nui ka Denaturation no ka hoʻonui PCR. Inā he haʻahaʻa ka mahana denaturation a he pōkole ka manawa denaturation, hiki ke loaʻa nā hewa hewa; he haʻahaʻa loa ka mahana annealing, hiki ke hoʻonui i ka hoʻonui ʻole a hoʻemi i ka pono amplification kikoʻī. He kiʻekiʻe loa ka mahana o ka annealing. Hoʻopilikia nui i ka hoʻopaʻa ʻana o nā primers i nā templates a hōʻemi i ka pono o ka amplification PCR. I kekahi manawa pono e hoʻohana i ka thermometer maʻamau e nānā i ka denaturation, annealing a me ka hoʻonui ʻana i nā mahana i loko o ka amplifier a i ʻole ka ipu wai. ʻO kēia kekahi o nā kumu no ka hemahema o ka PCR. Ka hoʻololi ʻana o ke kaʻina hana: Inā hoʻololi ʻia a holoi ʻia paha ke kaʻina i hoʻopaʻa ʻia, e pili ana i ka hoʻopaʻa pono ʻana o ka primer i ka template, a i ʻole e nalowale ke kaʻina kumu a me ka laʻana ma muli o ka holoi ʻana i kekahi māhele o ka kaʻina i manaʻo ʻia, ʻo ka PCR amplification. ʻaʻole e holomua.

2.false maikaʻi ʻO ka puʻupuʻu PCR amplification e ʻike ʻia e kūlike me ka pūʻulu kaʻina i hoʻopaʻa ʻia, a i kekahi manawa ʻoi aku ka hoʻonohonoho ʻana a me ka mālamalama. ʻAʻole kūpono ka hoʻolālā kumu mua: ʻO ka homology i koho ʻia i ka hoʻonui ʻia me ke kaʻina hoʻonui ʻole i hoʻopaʻa ʻia, no laila i ka wā e hana ana i ka hoʻonui PCR, ʻo ka huahana PCR i hoʻonui ʻia he kaʻina hana ʻole. Inā pōkole loa ke kaʻina i manaʻo ʻia a pōkole paha ke kumu mua, hiki ke maʻalahi nā hopena hoʻopunipuni. Pono e hoʻolālā hou ʻia nā Primers. ʻO ka hoʻohaumia ʻana o nā kaʻina i hoʻopaʻa ʻia a i ʻole nā ​​​​huahana hoʻonui: ʻElua kumu o kēia hoʻohaumia ʻana: ʻO ka mua, ʻo ka hoʻohaumia ʻana o ka genome holoʻokoʻa a i ʻole nā ​​ʻāpana nui, e alakaʻi ana i nā hopena maikaʻi ʻole. Hiki ke hoʻoholo ʻia kēia manaʻo maikaʻi ʻole ma kēia mau ʻano: E akahele a akahai i ka hana ʻana i mea e pale aku ai i ke kaʻina o ka pahuhopu mai ka omo ʻana i loko o ka pū hāpana a i ʻole ka pīpī ʻana mai loko mai o ka paipu centrifuge. Ma waho aʻe o nā enzymes a me nā mea ʻaʻole hiki ke kū i nā wela kiʻekiʻe, pono e hoʻomaʻemaʻe ʻia nā reagents a me nā mea hana a pau e ke kaomi kiʻekiʻe. Pono e hoʻohana ʻia nā paipu centrifuge a pau a me nā ʻōlelo aʻoaʻo pipette hoʻāno. Inā pono, e hoʻomāliʻi ʻia nā paipu hopena a me nā reagents me ke kukui ultraviolet ma mua o ka hoʻohui ʻana i ka specimen e hoʻopau i nā ʻakika nucleic i loaʻa. ʻO ka lua, ʻo ka hoʻohaumia ʻana i nā ʻāpana liʻiliʻi o nā ʻakika nucleic i ka lewa. ʻOi aku ka pōkole o kēia mau ʻāpana liʻiliʻi ma mua o ke kaʻina i hoʻopaʻa ʻia, akā loaʻa kekahi homology. Hiki ke hoʻopili ʻia kekahi i kekahi, a ma hope o ka hoʻohui ʻana i nā primers, hiki ke hoʻonui ʻia nā huahana PCR, e hopena i nā hopena maikaʻi ʻole, hiki ke hōʻemi a hoʻopau ʻia e nā ʻano PCR nested.

 

3. Hōʻike ʻia nā pūʻulu hoʻonui ʻole ʻAʻole i kūlike nā kaha i ʻike ʻia ma hope o ka hoʻonui ʻia ʻana o PCR me ka nui i manaʻo ʻia, ʻoi aku ka nui a i ʻole ka liʻiliʻi, a i ʻole ʻelua mau pūʻulu hoʻonui kikoʻī a me nā pūʻulu hoʻonui ʻole kikoʻī i ka manawa like. ʻO nā kumu o ka ʻike ʻia ʻana o nā kāʻei kikoʻī ʻole: ʻo ka mea mua, ʻaʻole i hoʻokō pono nā primers i ke kaʻina i hoʻopaʻa ʻia, a i ʻole nā ​​​​hui kumu mua e hana i nā dimer. ʻO ke kumu ʻelua, ʻoi aku ka kiʻekiʻe o ka Mg2+ ion, haʻahaʻa loa ka mahana annealing, a kiʻekiʻe loa ka helu o nā pōʻai PCR. ʻO ke kumu ʻelua ka maikaʻi a me ka nui o ka enzyme. Hiki pinepine nā enzyme mai kekahi mau kumu i nā pūnaʻi kikoʻī ʻole akā ʻaʻole nā ​​enzyme mai nā kumu ʻē aʻe. Hiki i ka nui o nā enzymes ke alakaʻi i kekahi manawa i ka hoʻonui ʻole. ʻO nā mea hoʻopaʻapaʻa he: hoʻolālā hou i nā primers inā pono. E hoʻemi i ka nui o ka enzyme a i ʻole e hoʻololi iā ia me kahi kumu ʻē aʻe. E ho'ēmi i ka nui o nā primers, e hoʻonui i ka nui o ka template ma ke kūpono, a e hoʻemi i ka helu o nā pōʻai. E hoʻonui i ka mahana annealing ma ke kūpono a i ʻole e hoʻohana i ke ʻano helu helu ʻelua (denaturation ma 93°C, annealing a hoʻonui ma kahi o 65°C).

 

4. Hōʻike ʻia ka hoʻonui ʻia ʻana o ka PCR i kekahi manawa ma ke ʻano he mau kaula i hoʻoheheʻe ʻia, nā ʻāpana like ʻole o ka pepa a i ʻole nā ​​​​pepa e like me ke kāpeti. Hoʻokumu pinepine ʻia nā kumu ma muli o ka nui o ka enzyme a i ʻole ka maikaʻi ʻole o ka enzyme, ke kiʻekiʻe o ka ʻike dNTP, ke kiʻekiʻe o ka Mg2+ ka nui, ka haʻahaʻa haʻahaʻa o ka annealing, a me ka nui o nā pōʻai. ʻO nā mea hoʻohālikelike: ① E hoʻemi i ka nui o ka enzyme, a i ʻole e hoʻololi i ka enzyme me kahi kumu ʻē aʻe. ②E ho'ēmi i ka manaʻo o ka dNTP. E hoemi pono i ka Mg2+. E hoʻonui i ka nui o nā templates a hoʻemi i ka helu o nā pōʻai