PCR FAQ 1. Ƙarya mara kyau, babu ƙararrawa band ya bayyana 2. Ƙarya mai kyau 3. Ƙwararrun ƙararrawa marasa ƙayyadaddun suna bayyana 4. Jakunkuna mai laushi ko smear tube ya bayyana:
1Karya mara kyau, babu ƙararrakin band wanda ya bayyana Maɓallan abubuwan da PCR ke da shi shine
① shirye-shiryen samfurin nucleic acid
② inganci na farko da ƙayyadaddun bayanai
③ ingancin enzyme da
④ Yanayin sake zagayowar PCR. Don nemo dalilan, ya kamata kuma a gudanar da bincike da bincike akan hanyoyin da ke sama.
Samfura:
① Samfurin ya ƙunshi sunadaran ƙazanta
② Samfurin ya ƙunshi Taq enzyme inhibitors
③ Sunadaran da ke cikin samfuri ba a narkar da su da cire su, musamman ma histones a cikin chromosomes.
④ An yi asarar da yawa yayin hakar da shirye-shiryen samfurin, ko kuma an shakar phenol
⑤ Samfurin nucleic acid ba a cire shi gaba daya ba. Lokacin da ingancin enzymes da furotin suna da kyau, idan ƙararrakin ƙarawa ba su bayyana ba, yana yiwuwa cewa akwai wani abu da ba daidai ba tare da tsarin narkewar samfurin ko tsari na cire nucleic acid. Sabili da haka, dole ne a shirya maganin narkewa mai inganci da kwanciyar hankali, kuma yakamata a gyara tsarin kuma kada a canza shi yadda ake so. . Rashin kunna Enzyme: Wajibi ne a maye gurbin sabon enzyme, ko amfani da duka tsofaffi da sababbin enzymes a lokaci guda don nazarin ko rashin kuskuren ƙarya yana haifar da asara ko rashin isasshen aikin enzyme. Ya kamata a lura cewa wani lokacin ana mantawa da enzyme Taq.Firafi: inganci na farko, ƙaddamarwa na farko, da kuma ko ƙaddamar da abubuwan da aka tsara na biyu sune dalilai na yau da kullum don gazawar PCR ko ƙananan haɓakaccen haɓakawa da sauƙi. Akwai matsaloli tare da ingancin haɗawar firamare a wasu batches. Ɗaya daga cikin abubuwan farko guda biyu yana da babban taro kuma ɗayan yana da ƙananan ƙididdiga, wanda ya haifar da ƙananan haɓakar asymmetric.
Matakan magance su sune:
① Zaɓi na'ura mai ƙima mai kyau.
② Ƙaddamar da ƙaddamarwa ya kamata ba kawai dubi darajar OD ba, amma kuma kula da samfurin samfurin samfurin don agarose gel electrophoresis. Dole ne a sami maƙallan farko, kuma haske na maɗaurin farko ya kamata su kasance kusan iri ɗaya. Alal misali, ɗaya na farko yana da bandeji kuma ɗayan ba shi da bandeji. Don tsiri, PCR na iya gazawa a wannan lokacin kuma yakamata a warware ta ta hanyar tattaunawa tare da sashin haɗin kai. Idan ɗaya na farko yana da haske mai girma kuma ɗayan yana da ƙananan haske, daidaita ma'auni yayin diluting na firam.
③ Yakamata a adana abubuwan farko a cikin babban taro da ƙananan ƙima don hana maimaita daskarewa da narke ko adana na dogon lokaci a cikin firiji, wanda zai iya haifar da lalacewa da lalata kayan aikin.
④ Zane-zane na farko ba shi da ma'ana, irin su tsawon lokaci bai isa ba, an kafa dimers tsakanin masu farawa, da dai sauransu Mg2 + maida hankali: Mg2 + ion maida hankali yana da tasiri mai girma akan ingantaccen haɓaka PCR. Idan maida hankali ya yi yawa, zai iya rage ƙayyadaddun haɓakawa na PCR. Idan maida hankali ya yi ƙasa da ƙasa, zai shafi yawan haɓakar haɓakar PCR har ma ya sa haɓakawar PCR ta gaza ba tare da ƙara ƙarfi ba. Canje-canje a cikin ƙarar amsa: Yawancin lokaci kundin da ake amfani da su don haɓaka PCR sune 20ul, 30ul, da 50ul. Ko 100ul, wane ƙarar da ya kamata a yi amfani da shi don haɓaka PCR an saita shi bisa ga dalilai daban-daban na binciken kimiyya da gwajin asibiti. Bayan yin ƙaramin ƙara, kamar 20ul, sannan yin ƙarar girma, dole ne ku bi sharuɗɗan, in ba haka ba zai iya yin kasawa cikin sauƙi. Dalilan jiki: Denaturation yana da matukar mahimmanci don haɓaka PCR. Idan zafin denaturation ya yi ƙasa kuma lokacin denaturation ya yi gajere, ƙila za a iya haifar da rashin ƙarfi na ƙarya; zafin jiki na annealing yayi ƙasa da ƙasa, wanda zai iya haifar da haɓakawa mara kyau kuma ya rage ƙayyadaddun haɓakar haɓakawa. Zazzaɓin zafi ya yi yawa. Yana tasiri sosai akan ɗaurin firamare zuwa samfuri kuma yana rage haɓakar haɓakawa na PCR. Wani lokaci ya zama dole a yi amfani da ma'aunin ma'aunin zafi da sanyio don duba yanayin zafi, raɗaɗi da haɓakawa a cikin amplifier ko tukunyar ruwa mai narkewa. Wannan kuma yana ɗaya daga cikin dalilan gazawar PCR. Bambancin jerin maƙasudi: Idan an canza jerin maƙasudi ko sharewa, wanda ke shafar takamaiman ɗaurin firam ɗin zuwa samfuri, ko kuma ƙirar ƙira da samfuri sun rasa jerin abubuwan da suka dace saboda share wani yanki na jeri na manufa, haɓaka PCR ba zai yi nasara ba.
2.ƙaryata Ƙarya Ƙarƙashin Ƙarfafawa na PCR da ke bayyana ya yi daidai da jerin jerin abubuwan da aka yi niyya, kuma wani lokacin band din ya fi tsari da haske. Ƙirar firamare mara dacewa: Zaɓaɓɓen jeri na haɓakawa yana da homology tare da jerin ƙarawa marasa manufa, don haka lokacin yin haɓakawa na PCR, ingantaccen samfurin PCR jerin marasa manufa ne. Idan jerin abubuwan da aka yi niyya sun yi gajeru sosai ko kuma maƙasudin ya yi gajere, ƙimar ƙarya na iya faruwa cikin sauƙi. Ana buƙatar sake fasalin abubuwan farko. Girke-girke na jeri na niyya ko kayan haɓakawa: Akwai dalilai guda biyu na wannan gurɓataccen abu: Na farko, ƙetare gabaɗayan kwayoyin halitta ko manyan gutsuttsura, yana haifar da tabbataccen ƙarya. Ana iya magance wannan tabbataccen ƙarya ta hanyoyi masu zuwa: Yi hankali da tausasawa yayin aiki don hana jerin abubuwan da aka yi niyya tsotsa cikin bindigar samfurin ko fantsama daga bututun centrifuge. Ban da enzymes da abubuwan da ba za su iya jure yanayin zafi ba, duk reagents ko kayan aiki ya kamata a haifuwa ta babban matsa lamba. Ya kamata a yi amfani da duk bututun centrifuge da shawarwarin pipette samfurin allura sau ɗaya. Idan ya cancanta, ana kunna bututun amsawa da reagents tare da hasken ultraviolet kafin ƙara samfurin don lalata ƙwayoyin nucleic da ke akwai. Na biyu shine gurɓatar ƙananan gutsuttsuran acid nucleic a cikin iska. Waɗannan ƙananan gutsuttsura sun fi jerin abubuwan da aka yi niyya gajarta, amma suna da ƙayyadaddun ƙayyadaddun magana. Ana iya raba su da juna, kuma bayan sun kasance masu dacewa da abubuwan da aka tsara, ana iya haɓaka samfuran PCR, wanda ke haifar da ƙimar ƙarya, wanda za'a iya ragewa ko kawar da su ta hanyar hanyoyin PCR.
3.Ban ƙayyadaddun maƙallan haɓakawa ba suna bayyana Ƙungiyoyin da ke bayyana bayan haɓakawa na PCR ba su dace da girman da ake tsammani ba, ko dai ya fi girma ko ƙarami, ko duka ƙayyadaddun ƙayyadaddun maƙallan ƙarawa da ƙananan ƙararrawa ba su bayyana a lokaci guda. Dalilan bayyanar makada da ba na musamman ba su ne: na farko, ginshiƙan ba su da cikakkiyar ma'amala da jerin abubuwan da aka yi niyya, ko kuma abubuwan da aka haɗa su zama dimers. Dalili na biyu shi ne cewa ƙaddamarwar Mg2+ ion ya yi yawa sosai, yanayin zafi yana raguwa sosai, kuma yawan hawan PCR ya yi yawa. Abu na biyu shine inganci da adadin enzyme. Enzymes daga wasu kafofin sau da yawa suna da haɗari ga ƙungiyoyi marasa takamaiman amma enzymes daga wasu tushe ba sa. Yawan adadin enzymes a wasu lokuta na iya haifar da haɓaka da ba takamaiman ba. Ma'auni sun haɗa da: sake zayyana firamare idan ya cancanta. Rage adadin enzyme ko maye gurbin shi da wani tushe. Rage adadin firamare, ƙara adadin samfuri daidai, da rage adadin zagayowar. Ƙara yawan zafin jiki wanda ya dace ko amfani da hanyar yanayin zafi biyu (denaturation a 93 ° C, annealing da tsawo a kusa da 65 ° C).
4.Flaky ja ko smears bayyana PCR amplification wani lokacin yana bayyana a matsayin smeared makada, takardar-kamar makada ko kafet-kamar makada. Dalilan galibi ana haifar da su ne ta hanyar yawan enzyme ko rashin ingancin enzyme, babban taro na dNTP, maɗaukakin maida hankali na Mg2+, ƙarancin zafin jiki, da yawan hawan keke. Ma'auni sun haɗa da: ① Rage adadin enzyme, ko maye gurbin enzyme da wani tushe. ②Rage taro na dNTP. Daidai rage yawan taro na Mg2+. Ƙara adadin samfuri kuma rage adadin zagayowar
