Ceistean Cumanta PCR 1. Mearachdach àicheil, chan eil còmhlan leudachaidh a’ nochdadh 2. Dearbhach meallta 3. Bidh bannan leudachaidh neo-shònraichte a’ nochdadh 4. Bidh stiallan slaodaidh no stiallan smear a’ nochdadh:
1 False àicheil, chan eil còmhlan leudaichte a’ nochdadh Is iad na prìomh thaobhan den fhreagairt PCR
① ullachadh teamplaid nucleic acid
② primer càileachd agus specificity
③ càileachd enzyme agus
④ Suidheachadh rothaireachd PCR. Gus na h-adhbharan a lorg, bu chòir mion-sgrùdadh agus rannsachadh a dhèanamh air na ceanglaichean gu h-àrd.
Teamplaid:
① Anns an teamplaid tha pròtainean neo-ghlan
② Anns an teamplaid tha luchd-bacadh enzyme Taq
③ Chan eil na pròtanan anns an teamplaid air an cnàmhadh agus air an toirt air falbh, gu sònraichte na h-histones ann an cromosoman
④ Chaidh cus a chall nuair a chaidh an teamplaid a thoirt a-mach agus a dheasachadh, no chaidh phenol a thoirt a-steach
⑤ Chan eil an teamplaid searbhag niuclasach air a dhì-nàdarachadh gu tur. Nuair a tha càileachd enzymes agus primers math, mura nochd bannan leudachaidh, tha e nas coltaiche gu bheil rudeigin ceàrr air pròiseas cnàmhaidh an t-sampall no an teamplaid pròiseas às-tharraing searbhag nucleic. Mar sin, feumar fuasgladh cnàmhaidh èifeachdach agus seasmhach ullachadh, agus bu chòir am modh-obrach a shuidheachadh agus cha bu chòir atharrachadh a rèir toil. . Neo-ghnìomhachd einnsein: Feumar an enzyme ùr a chuir an àite, no einnseanan sean is ùr a chleachdadh aig an aon àm gus sgrùdadh a dhèanamh a bheil àicheil meallta air adhbhrachadh le call no gnìomhachd enzyme gu leòr. Bu chòir a thoirt fa-near gu bheil uaireannan an Taq enzyme air a dhìochuimhneachadh.Primers: Primer càileachd, primer dùmhlachd, agus co-dhiù a tha an dùmhlachd an dà primers tha co-chothromach adhbharan cumanta airson PCR fàilligeadh no neo-riaraichte bannan leudachaidh agus furasta sgaoilidh. Tha duilgheadasan ann le càileachd synthesis primer ann an cuid de baidsean. Tha dùmhlachd àrd aig aon den dà primers agus tha dùmhlachd ìosal aig an fhear eile, a’ leantainn gu àrdachadh neo-chunbhalach le èifeachdas ìosal.
Is iad na ceumannan frith-rathaid:
① Tagh aonad synthesis primer math.
② Bu chòir don dùmhlachd de primers chan ann a-mhàin sùil a thoirt air luach OD, ach cuideachd aire a thoirt don fhuasgladh stoc primer airson electrophoresis gel agarose. Feumaidh bannan primer a bhith ann, agus bu chòir soilleireachd an dà chòmhlan primer a bhith timcheall air an aon rud. Mar eisimpleir, tha còmhlan aig aon primer agus chan eil còmhlan aig an primer eile. Airson stiallan, faodaidh PCR fàiligeadh aig an àm seo agus bu chòir a rèiteachadh tro cho-rèiteachadh leis an aonad synthesis primer. Ma tha soilleireachd àrd aig aon primer agus gu bheil soilleireachd ìosal aig an fhear eile, cothromachadh na dùmhlachdan nuair a bhios tu a’ lagachadh na primers.
③ Bu chòir primers a bhith air an stòradh ann an dùmhlachd àrd agus meudan beaga gus casg a chuir air reothadh agus leaghadh no stòradh fad-ùine san fhrigeradair, a dh ’fhaodadh leantainn gu crìonadh agus truailleadh na primers.
④ Tha dealbhadh an primer mì-reusanta, leithid fad an primer nach eil gu leòr, tha dimers air an cruthachadh eadar primers, msaa. Mg2 + dùmhlachd: Tha buaidh mhòr aig dùmhlachd ion Mg2 + air èifeachdas àrdachadh PCR. Ma tha an dùmhlachd ro àrd, faodaidh e lùghdachadh a dhèanamh air cho sònraichte sa tha leudachadh PCR. Ma tha an dùmhlachd ro ìosal, bheir e buaidh air toradh leudachaidh PCR agus eadhon adhbharaichidh e leudachadh PCR gun a bhith ag àrdachadh bannan. Atharrachaidhean ann an tomhas freagairt: Mar as trice is e 20ul, 30ul, agus 50ul na leabhraichean a thathar a’ cleachdadh airson leudachadh PCR. No 100ul, tha an tomhas-lìonaidh a bu chòir a chleachdadh airson leudachadh PCR air a shuidheachadh a rèir diofar adhbharan airson rannsachadh saidheansail agus deuchainn clionaigeach. Às deidh dhut tomhas beag a dhèanamh, leithid 20ul, agus an uairsin tomhas-lìonaidh nas motha a dhèanamh, feumaidh tu na cumhaichean a leantainn, air neo bidh e furasta fàiligeadh. Adhbharan fiosaigeach: Tha dì-nàdarachadh glè chudromach airson leudachadh PCR. Ma tha an teòthachd dì-nàdarachadh ìosal agus gu bheil an ùine dì-nàdurachaidh goirid, tha e glè choltach gun tachair àicheil meallta; tha an teòthachd annealing ro ìosal, a dh’ fhaodadh leudachadh neo-shònraichte adhbhrachadh agus èifeachdas leudachaidh sònraichte a lughdachadh. Tha an teòthachd annealing ro àrd. A’ toirt buaidh mhòr air ceangal primers ri teamplaidean agus a’ lughdachadh èifeachdas leudachaidh PCR. Aig amannan feumar teirmiméadar àbhaisteach a chleachdadh gus sùil a thoirt air an teòthachd dì-nàdurrach, annealing agus leudachaidh anns an amplifier no pot soluble uisge. Is e seo cuideachd aon de na h-adhbharan airson fàilligeadh PCR. Atharrachadh sreath targaid: Ma thèid an t-sreath targaid a mhùthadh no a dhubhadh às, a bheir buaidh air ceangal sònraichte an primer ris an teamplaid, no ma chailleas am primer agus an teamplaid an t-sreath co-phàirteach mar thoradh air cuir às do earrann sònraichte den t-sreath targaid, an leudachadh PCR cha bhi soirbheachadh.
2.false positive Tha an còmhlan leudachaidh PCR a tha a 'nochdadh co-chòrdail ris a' chòmhlan sreath targaid, agus uaireannan tha an còmhlan nas òrdail agus nas gile. Dealbhadh primer neo-iomchaidh: Tha homology aig an t-sreath leudachaidh taghte leis an t-sreath leudachaidh neo-targaid, agus mar sin nuair a bhios tu a’ coileanadh àrdachadh PCR, is e sreath neo-targaid a th’ anns an toradh PCR leudaichte. Ma tha an t-sreath targaid ro ghoirid no ma tha am primer ro ghoirid, is dòcha gu bheil e furasta rudan ceàrr a nochdadh. Feumaidh primers ath-dhealbhadh. Tar-thruailleadh sreathan targaid no toraidhean leudachaidh: Tha dà adhbhar ann airson an truailleadh seo: An toiseach, tar-thruailleadh den genoma gu lèir no mìrean mòra, a’ leantainn gu nithean ceàrr. Faodar an dearbhadh meallta seo fhuasgladh leis na dòighean a leanas: Bi faiceallach agus socair nuair a bhios tu ag obair gus casg a chuir air an t-sreath targaid bho bhith air a suathadh a-steach don ghunna sampall no air a frasadh a-mach às an tiùb centrifuge. A bharrachd air enzymes agus stuthan nach urrainn seasamh ri teòthachd àrd, bu chòir a h-uile inneal no uidheamachd a bhith air an sterilachadh le cuideam àrd. Bu chòir a h-uile tiùb centrifuge agus molaidhean pìobaireachd stealladh sampall a chleachdadh aon uair. Ma tha feum air, bidh na tiùban ath-bhualadh agus na h-ath-bheachdan air an irradachadh le solas ultraviolet mus cuir iad an sampall ris gus na h-aigéid niuclasach a tha an làthair a sgrios. Is e an dàrna fear truailleadh mìrean beaga de dh’ aigéid nucleic san adhar. Tha na mìrean beaga sin nas giorra na an t-sreath targaid, ach tha homology sònraichte aca. Faodaidh iad a bhith air an splicadh ri chèile, agus an dèidh a bhith a 'cur ris na primers, faodar na stuthan PCR a mheudachadh, a' leantainn gu nithean ceàrr, a dh'fhaodar a lùghdachadh no a chuir às le dòighean PCR neadachaidh.
Bidh bannan leudachaidh 3.Non-specific a’ nochdadh Tha na bannan a nochdas às deidh leudachadh PCR neo-chunbhalach leis a’ mheud a thathar a’ sùileachadh, an dàrna cuid nas motha no nas lugha, no tha an dà chòmhlan leudachaidh sònraichte agus bannan leudachaidh neo-shònraichte a’ nochdadh aig an aon àm. Is e na h-adhbharan airson coltas bannan neo-shònraichte: an toiseach, chan eil na primers gu tur a’ cur ris an t-sreath targaid, no bidh na primers a’ cruinneachadh gus dimers a chruthachadh. Is e an dàrna adhbhar gu bheil an dùmhlachd ion Mg2 + ro àrd, gu bheil an teòthachd annealing ro ìosal, agus gu bheil an àireamh de chuairtean PCR ro àrd. Is e an dàrna adhbhar càileachd agus meud an enzyme. Bidh einnseanan bho chuid de stòran gu tric buailteach do chòmhlain neo-shònraichte ach chan eil einnseanan bho thùsan eile. Uaireannan faodaidh cus enzymes leantainn gu leudachadh neo-shònraichte. Am measg nan ceumannan tha: ath-dhealbhadh primers ma tha sin riatanach. Lùghdaich an ìre de enzyme no cuir stòr eile na àite. Lùghdaich an àireamh de primers, àrdaich an àireamh de theamplaid gu h-iomchaidh, agus lughdaich an àireamh de chuairtean. Meudaich an teòthachd annealing gu h-iomchaidh no cleachd an dòigh puing dà-teòthachd (denaturation aig 93 ° C, annealing agus leudachadh timcheall air 65 ° C).
Bidh slaodadh no smeuran 4.Flaky a’ nochdadh uaireannan bidh leudachadh PCR a’ nochdadh mar chòmhlan smearaidh, bannan coltach ri duilleag no bannan coltach ri brat-ùrlair. Tha na h-adhbharan gu tric air an adhbhrachadh le cus enzyme no droch chàileachd enzyme, dùmhlachd dNTP ro àrd, dùmhlachd Mg2+ ro àrd, teòthachd ro ìosal annealing, agus cus chuairtean. Am measg nan ceumannan-tomhais tha: ① Lùghdaich an ìre de enzyme, no cuir stòr eile an àite an enzyme. ② Lùghdaich dùmhlachd dNTP. Lùghdaich gu h-iomchaidh an dùmhlachd Mg2+. Meudaich an àireamh de theamplaidean agus lughdaich an àireamh de chuairtean
