PCR CC 1. Diúltach bréagach, níl aon bhanda aimpliúcháin le feiceáil 2. Bréagach dearfach 3. Bannaí aimpliúcháin neamhshonracha le feiceáil 4. Stiallacha tarraingthe calógacha nó stiallacha smearaidh le feiceáil:
1Bréagach diúltach, níl aon bhanda aimplithe le feiceáil Is iad na príomhghnéithe den imoibriú PCR
① ullmhú d'aigéad núicléach teimpléad
② cáilíocht primer agus sainiúlacht
③ cáilíocht einsím agus
④ coinníollacha timthriall PCR. Chun na cúiseanna a fháil, ba cheart anailís agus taighde a dhéanamh ar na naisc thuas freisin.
Teimpléad:
① Tá próitéiní eisíontas sa teimpléad
② Tá coscairí einsím Taq sa teimpléad
③ Ní dhéantar na próitéiní sa teimpléad a dhíleá agus a bhaint, go háirithe na histones i gcromosóim
④ Cailleadh an iomarca le linn eastóscadh agus ullmhú an teimpléid, nó rinneadh feanól a ionanálú
⑤ Níl an teimpléad aigéad núicléach dínádúraithe go hiomlán. Nuair a bhíonn cáilíocht na n-einsímí agus na primers go maith, mura bhfuil bannaí aimpliúcháin le feiceáil, is dóichí go bhfuil rud éigin cearr le próiseas díleá an eiseamail nó leis an teimpléad próiseas eastósctha aigéad núicléasach. Dá bhrí sin, ní mór réiteach díleá éifeachtach agus cobhsaí a ullmhú, agus ba cheart an nós imeachta a shocrú agus níor cheart é a athrú de réir toil. . Díghníomhú einsím: Is gá an einsím nua a athsholáthar, nó einsímí sean agus nua a úsáid ag an am céanna chun anailís a dhéanamh an bhfuil claonchlónna bréagacha de bharr caillteanas nó gníomhaíocht einsím neamhleor. Ba chóir a thabhairt faoi deara go bhfuil uaireanta dearmad ar an einsím Taq.Primers: Tá cáilíocht primer, tiúchan primer, agus cibé an bhfuil an tiúchan den dá primers siméadrach cúiseanna coitianta le teip PCR nó bannaí aimpliú míshásúil agus idirleathadh éasca. Tá fadhbanna le cáilíocht na sintéise primer i roinnt baisceanna. Tá tiúchan ard ag ceann amháin den dá primers agus tá tiúchan íseal ag an gceann eile, rud a fhágann go bhfuil aimpliú neamhshiméadrach íseal-éifeachtúlachta.
Is iad na frithbhearta ná:
① Roghnaigh aonad sintéise primer maith.
② Níor cheart go bhféachfadh tiúchan na primers ach ar an luach OD, ach freisin aird a thabhairt ar an réiteach stoc primer le haghaidh leictreafóiréis glóthach agarose. Ní mór go mbeadh bannaí primer ann, agus ba cheart go mbeadh gile an dá bhanna primer thart ar an gcéanna. Mar shampla, tá banna ag primer amháin agus níl aon bhanna ag an primer eile. Maidir le stiallacha, d'fhéadfadh go dteipeann ar PCR ag an am seo agus ba cheart é a réiteach trí idirbheartaíocht leis an aonad sintéise primer. Má tá gile ard ag primer amháin agus gile íseal ag an gceann eile, cothromaíocht a dhéanamh ar na tiúchana agus na primers á gcaolú.
③ Ba chóir primers a stóráil i dtiúchan ard agus i gcainníochtaí beaga chun cosc a chur ar reo agus leá arís agus arís eile nó a stóráil go fadtéarmach sa chuisneoir, rud a d'fhéadfadh meath agus díghrádú a dhéanamh ar na primers.
④ Tá an dearadh primer míréasúnta, mar shampla nach bhfuil an fad primer go leor, déantar dimers idir primers, etc. Mg2+ tiúchan: Tá tionchar mór ag tiúchan ian Mg2+ ar éifeachtacht aimplithe PCR. Má tá an tiúchan ró-ard, féadfaidh sé sainiúlacht aimplithe PCR a laghdú. Má tá an tiúchan ró-íseal, beidh tionchar aige ar an toradh aimplithe PCR agus fiú ina chúis le teip ar an aimpliú PCR gan bannaí aimpliú. Athruithe ar an méid imoibrithe: De ghnáth is iad na méideanna a úsáidtear le haghaidh aimpliú PCR ná 20ul, 30ul, agus 50ul. Nó 100ul, tá an méid ba cheart a úsáid le haghaidh aimpliú PCR socraithe de réir críocha éagsúla taighde eolaíoch agus tástála cliniciúla. Tar éis toirt beag a dhéanamh, mar shampla 20ul, agus ansin toirt níos mó a dhéanamh, ní mór duit na coinníollacha a leanúint, ar shlí eile beidh sé theipeann go héasca. Cúiseanna fisiceacha: Tá dínádúrú an-tábhachtach le haghaidh aimpliú PCR. Má tá an teocht dínádúraithe íseal agus go bhfuil an t-am dínádúraithe gearr, is beag an seans go dtarlóidh claonchlónna bréagach; tá an teocht annealing ró-íseal, rud a d'fhéadfadh a bheith ina chúis le aimpliú neamh-shonrach agus an éifeachtacht aimplithe sonrach a laghdú. Tá an teocht annealing ró-ard. Cuireann sé isteach go mór ar cheangal primers le teimpléid agus laghdaítear éifeachtúlacht aimplithe PCR. Uaireanta is gá teirmiméadar caighdeánach a úsáid chun an teocht dínádúraithe, annealing agus síneadh a sheiceáil san aimplitheoir nó sa phota intuaslagtha in uisce. Tá sé seo ar cheann de na cúiseanna freisin le teip PCR. Athrú seicheamh sprice: Má dhéantar an seicheamh sprice a athrú nó a scriosadh, rud a dhéanann difear do cheangal sonrach an primer leis an teimpléad, nó má chailleann an primer agus an teimpléad an t-ord comhlántach mar gheall ar scriosadh deighleog áirithe den seicheamh sprice, an t-aimpliú PCR ní bheidh rath.
2.false dearfach Tá an banna aimplithe PCR atá le feiceáil comhsheasmhach leis an mbanda seicheamh sprioc, agus uaireanta tá an banna níos ordúil agus níos gile. Dearadh primer míchuí: Tá homaleolaíocht ag an seicheamh aimpliúcháin roghnaithe leis an seicheamh aimpliúcháin neamh-sprioc, agus mar sin nuair a bhíonn aimpliú PCR á dhéanamh, is seicheamh neamh-sprioc é an táirge aimplithe PCR. Má tá an seicheamh sprice ró-ghearr nó má tá an primer ró-ghearr, is féidir go dtarlódh dearfacha bréagacha go héasca. Ní mór primers a athdhearadh. Tras-éilliú seichimh sprice nó táirgí aimpliúcháin: Tá dhá chúis leis an éilliú seo: Ar an gcéad dul síos, tras-éilliú an ghéanóm ar fad nó blúirí móra, rud a fhágann dearfacha bréagacha. Is féidir an deimhneach bréagach seo a réiteach ar na modhanna seo a leanas: Bí cúramach agus milis agus tú ag oibriú chun an seicheamh sprice a chosc ó bheith tarraingthe isteach sa gunna samplach nó splancadh amach as an bhfeadán lártheifneora. Seachas einsímí agus substaintí nach féidir leo teochtaí arda a sheasamh, ba cheart gach imoibrí nó trealamh a steiriliú le brú ard. Ba cheart gach feadáin lártheifneora agus leideanna samplacha pípéad insteallta a úsáid uair amháin. Más gá, déantar na feadáin imoibriúcháin agus na himoibrithe a ionradaithe le solas ultraivialait sula gcuirtear an t-eiseamal leis chun na haigéid núicléacha atá i láthair a scriosadh. Is é an dara ceann éilliú blúirí beaga aigéid núicléacha san aer. Tá na blúirí beaga seo níos giorra ná an seicheamh sprice, ach tá homaleolaíocht áirithe acu. Is féidir iad a spliced dá chéile, agus tar éis a bheith comhlántach leis na primers, is féidir na táirgí PCR a aimpliú, a eascraíonn i dearfacha bréagach, is féidir a laghdú nó a dhíchur trí mhodhanna PCR neadaithe.
3.Banna aimpliúcháin neamhshonracha le feiceáil Tá na bannaí atá le feiceáil tar éis aimpliú PCR ar neamhréir leis an méid a bhfuiltear ag súil leis, níos mó nó níos lú, nó bíonn bannaí aimplithe sainiúla agus bannaí aimpliúcháin neamhshonracha le feiceáil ag an am céanna. Is iad na cúiseanna atá le cuma bannaí neamhshonracha ná: ar dtús, níl na primers comhlántach go hiomlán leis an seicheamh sprice, nó comhiomlán na primers chun dimers a fhoirmiú. Is é an dara chúis ná go bhfuil an tiúchan ian Mg2+ ró-ard, tá an teocht annealing ró-íseal, agus tá líon na dtimthriallta PCR ró-ard. Is é an dara fachtóir cáilíocht agus cainníocht an einsím. Is minic go mbíonn bannaí neamhshonracha ag einsímí ó fhoinsí áirithe ach ní dhéanann einsímí ó fhoinsí eile. Uaireanta is féidir aimpliú neamhshonrach a bheith mar thoradh ar mhéideanna iomarcacha einsímí. Áirítear ar na frithbhearta: primers a athdhearadh más gá. Laghdaigh méid na heinsíme nó cuir foinse eile ina ionad. Laghdaigh méid na primers, an méid teimpléad a mhéadú go cuí, agus líon na dtimthriallta a laghdú. Méadaigh an teocht annealaithe go cuí nó bain úsáid as an modh pointe dhá theocht (dínádúrú ag 93 °C, annealing agus síneadh timpeall 65 °C).
4. Is cosúil go bhfuil tarraing nó smearaidh scagach le feiceáil uaireanta is cosúil go bhfuil aimpliú PCR mar bhannaí smeartha, bannaí cosúil le bileog nó bannaí cosúil le cairpéad. Is minic a bhíonn na cúiseanna mar gheall ar an iomarca einsím nó droch-chaighdeán einsím, tiúchan dNTP ró-ard, tiúchan ró-ard Mg2+, teocht annealing ró-íseal, agus iomarca timthriallta. Áirítear ar na frithbhearta: ① Laghdaigh méid na heinsíme, nó cuir foinse eile in ionad an einsím. ② Laghdaigh an tiúchan dNTP. Laghdaigh an tiúchan Mg2+ go cuí. Méadú ar an méid teimpléid agus laghdú ar líon na dtimthriallta
