PCR FAQ 1. Falsk negatyf, gjin amplification band ferskynt 2. False positive 3. Net-spesifike amplification bands ferskine 4. Flaky drag strips of smeer strips ferskine:
1False negatyf, gjin fersterke band ferskynt De wichtichste aspekten fan 'e PCR-reaksje binne
① tarieding fan template nucleic acid
② primer kwaliteit en spesifisiteit
③ enzyme kwaliteit en
④ PCR syklus betingsten. Om de redenen te finen, moatte analyse en ûndersyk ek wurde útfierd op 'e boppesteande keppelings.
Sjabloan:
① It sjabloan befettet ûnreinheidsproteinen
② It sjabloan befettet Taq-enzyminhibitoren
③ De aaiwiten yn 'e sjabloan wurde net digested en fuortsmiten, benammen de histones yn chromosomen
④ Tefolle gie ferlern by de winning en tarieding fan it sjabloan, as fenol waard ynademe
⑤De sjabloan nukleïnesûr is net folslein denaturearre. Wannear't de kwaliteit fan enzymen en primers is goed, as amplification bands net ferskine, it is nei alle gedachten dat der wat mis mei de spiisfertarring proses fan it eksimplaar of it sjabloan nucleic acid ekstraksje proses. Dêrom moat in effektive en stabile oplossing foar spiisfertarring wurde taret, en de proseduere moat fêststeld wurde en moat net feroare wurde. . Enzyme-ynaktivering: It is needsaaklik om it nije enzyme te ferfangen, of sawol âlde as nije enzymen tagelyk te brûken om te analysearjen oft falske negativen wurde feroarsake troch ferlies of ûnfoldwaande enzymaktiviteit. Dêrby moat opmurken wurde dat soms de Taq enzyme wurdt forgetten.Primers: Primer kwaliteit, primer konsintraasje, en oft de konsintraasjes fan de twa primers binne symmetrysk binne mienskiplike redenen foar PCR mislearjen of ûnfoldwaande amplification bands en maklik diffusion. D'r binne problemen mei de kwaliteit fan primersynteze yn guon batches. Ien fan 'e twa primers hat in hege konsintraasje en de oare hat in lege konsintraasje, wat resulteart yn lege-effisjinsje asymmetryske amplifikaasje.
De tsjinmaatregels binne:
① Selektearje in goede primersynteze-ienheid.
② De konsintraasje fan primers moat net allinich nei de OD-wearde sjen, mar ek omtinken jaan oan 'e primer-stockoplossing foar agarosegelelektroforese. D'r moatte primerbands wêze, en de helderheid fan 'e twa primerbands moat sawat itselde wêze. Bygelyks, ien primer hat in band en de oare primer hat gjin band. Foar strips kin PCR op dit stuit mislearje en moat wurde oplost troch ûnderhanneling mei de primersynteze-ienheid. As de iene primer hege helderheid hat en de oare in lege helderheid, balansearje dan de konsintraasjes by it ferwetterjen fan de primers.
③ Primers moatte wurde opslein yn hege konsintraasje en lytse hoemannichten te kommen werhelle freezing en thawing of lange-termyn opslach yn 'e kuolkast, dat kin liede ta efterútgong en degradaasje fan de primers.
④It primerûntwerp is ûnferstannich, lykas de primerlange is net genôch, dimers wurde foarme tusken primers, ensfh. Mg2+ konsintraasje: Mg2+ ionkonsintraasje hat in grutte ynfloed op PCR-amplifikaasje-effisjinsje. As de konsintraasje te heech is, kin it de spesifisiteit fan PCR-amplifikaasje ferminderje. As de konsintraasje te leech is, sil it de PCR-amplifikaasje-opbringst beynfloedzje en sels feroarsaakje dat de PCR-amplifikaasje mislearret sûnder amplifying bands. Feroaringen yn reaksjevolumint: Gewoanlik binne de folumes dy't brûkt wurde foar PCR-amplifikaasje 20ul, 30ul, en 50ul. Of 100ul, hokker folume moat wurde brûkt foar PCR-amplifikaasje is ynsteld neffens ferskate doelen fan wittenskiplik ûndersyk en klinyske testen. Nei it meitsjen fan in lyts folume, lykas 20ul, en dan it meitsjen fan in grutter folume, moatte jo de betingsten folgje, oars sil it maklik mislearje. Fysike redenen: Denaturaasje is heul wichtich foar PCR-amplifikaasje. As de denaturaasjetemperatuer leech is en de denaturaasjetiid koart is, binne der tige wierskynlik falske negativen; de annealing temperatuer is te leech, dat kin feroarsaakje net-spesifike amplification en ferminderjen de spesifike amplification effisjinsje. De annealing temperatuer is te heech. Heech beynfloedet de bining fan primers oan sjabloanen en ferminderet PCR-amplifikaasje-effisjinsje. Soms is it nedich om in standert thermometer te brûken om de temperatueren foar denaturaasje, annealing en útwreiding yn 'e fersterker of wetteroplosbere pot te kontrolearjen. Dit is ek ien fan 'e redenen foar PCR-mislearring. Doelsekwinsjefariaasje: As de doelsekwinsje mutearre of wiske is, wat de spesifike bining fan 'e primer oan' e sjabloan beynfloedet, of de primer en sjabloan ferlieze de komplementêre folchoarder fanwege it wiskjen fan in bepaald segmint fan 'e doelsekwinsje, de PCR-amplifikaasje sil net suksesfol wêze.
2.false posityf De PCR-amplifikaasjebân dy't ferskynt is konsistint mei de doelsekwinsjeband, en soms is de band mear oarderlik en helderder. Unappropriate primer-ûntwerp: De selektearre amplifikaasje-sekwinsje hat homology mei de non-target-amplifikaasje-sekwinsje, dus by it útfieren fan PCR-amplifikaasje is it amplified PCR-produkt in net-target-sekwinsje. As de doelsekwinsje te koart is of de primer te koart is, kinne falske positives maklik foarkomme. Primers moatte wurde opnij ûntwurpen. Cross-kontaminaasje fan doelsekwinsjes of amplifikaasjeprodukten: D'r binne twa redenen foar dizze fersmoarging: Earste, cross-contamination fan it hiele genom of grutte fragminten, dy't liede ta falske positiven. Dit falske posityf kin oplost wurde troch de folgjende metoaden: Wês foarsichtich en sêft by it operearjen om foar te kommen dat de doelsekwinsje yn it stekproefgewear sûge of út 'e sintrifugebuis spatte. Utsein enzymen en stoffen dy't gjin hege temperatueren kinne wjerstean, moatte alle reagenzjes as apparatuer mei hege druk sterilisearre wurde. Alle sintrifuge buizen en pipettetips foar sample-ynjeksje moatte ien kear brûkt wurde. As it nedich is, wurde de reaksjebuizen en reagenzjes bestraald mei ultraviolet ljocht foardat it eksimplaar tafoege wurdt om de oanwêziche nukleïnesoeren te ferneatigjen. De twadde is de fersmoarging fan lytse fragminten fan nukleïnesoeren yn 'e loft. Dizze lytse fragminten binne koarter as de doelsekwinsje, mar hawwe bepaalde homology. Se kinne oan elkoar sletten wurde, en nei't se komplementêr binne oan 'e primers, kinne de PCR-produkten wurde fersterke, wat resulteart yn falske positiven, dy't kinne wurde fermindere of elimineare troch nestele PCR-metoaden.
3.Non-spesifike amplification bands ferskine De bands dy't ferskine nei PCR amplification binne net yn oerienstimming mei de ferwachte grutte, itsij grutter of lytser, of beide spesifike amplification bands en net-spesifike amplification bands ferskine tagelyk. De redenen foar it ferskinen fan net-spesifike bands binne: earst binne de primers net folslein komplemintêr foar de doelsekwinsje, of de primers aggregearje om dimers te foarmjen. De twadde reden is dat de Mg2 + ion konsintraasje is te heech, de annealing temperatuer is te leech, en it oantal PCR cycles is te heech. De twadde faktor is de kwaliteit en kwantiteit fan it enzym. Enzymen út guon boarnen binne faak gefoelich foar net-spesifike bands, mar enzymen út oare boarnen net. Oermjittige hoemannichten enzymen kinne soms liede ta net-spesifike amplifikaasje. De tsjinmaatregels omfetsje: redesign primers as nedich. Ferminderje de hoemannichte enzyme of ferfange it mei in oare boarne. Ferminderje it bedrach fan primers, fergrutsje it bedrach fan sjabloan passend, en ferminderje it oantal syklusen. Ferheegje de annealingtemperatuer passend of brûk de twa-temperatuerpuntmetoade (denaturaasje by 93 ° C, annealing en útwreiding om 65 ° C).
4.Flaky drag of smear ferskine PCR amplification soms ferskynt as smearde bands, sheet-like bands of tapyt-like bands. De redenen wurde faak feroarsake troch tefolle enzyme of minne kwaliteit fan enzyme, te hege dNTP-konsintraasje, te hege Mg2+-konsintraasje, te leech annealingtemperatuer en te folle syklusen. De tsjinmaatregels omfetsje: ① Ferminderje de hoemannichte enzyme, of ferfange it enzym mei in oare boarne. ②Redigje de konsintraasje fan dNTP. Ferminderje de Mg2+ konsintraasje passend. Fergrutsje it oantal sjabloanen en ferminderje it oantal syklusen
