PCR FAQ 1. Väärin negatiivinen, ei vahvistusjuovia 2. Väärin positiivinen 3. Epäspesifisiä vahvistusjuovia ilmestyy 4. Näkyviin tulee hilseileviä vetoliuskoja tai tahranauhoja:

1 Väärin negatiivinen, ei amplifioitua vyöhykettä PCR-reaktion keskeiset näkökohdat ovat

① templaattinukleiinihapon valmistus

② pohjamaalin laatu ja spesifisyys

③ entsyymien laatu ja

④ PCR-sykliolosuhteet. Syiden selvittämiseksi kannattaa tehdä analyyseja ja tutkimuksia myös yllä olevista linkeistä.

Malli:

① Templaatti sisältää epäpuhtausproteiineja

② Templaatti sisältää Taq-entsyymi-inhibiittoreita

③ Templaatin proteiinit eivät pilkkoudu ja poistu, etenkään kromosomien histonit

④ Liian paljon hävisi mallineen uuttamisen ja valmistuksen aikana tai fenolia hengitettiin

⑤Templaattinukleiinihappo ei ole täysin denaturoitunut. Kun entsyymien ja alukkeiden laatu on hyvä, jos monistusjuovia ei esiinny, on mitä todennäköisimmin näytteen digestioprosessissa tai templaattinukleiinihapon uuttoprosessissa jotain vialla. Siksi on valmistettava tehokas ja vakaa ruoansulatusliuos, ja menettelyn tulee olla kiinteä, eikä sitä saa muuttaa mielensä mukaan. . Entsyymin inaktivointi: On tarpeen vaihtaa uusi entsyymi tai käyttää sekä vanhoja että uusia entsyymejä samanaikaisesti analysoimaan, johtuvatko väärät negatiivit entsyymien katoamisesta tai riittämättömästä aktiivisuudesta. On huomattava, että joskus Taq-entsyymi unohtuu. Alukkeet: Alukkeiden laatu, alukkeen pitoisuus ja se, ovatko kahden alukkeen pitoisuudet symmetrisiä, ovat yleisiä syitä PCR:n epäonnistumiseen tai epätyydyttäviin monistusvyöhykkeisiin ja helppoon diffuusioon. Joissakin erissä on ongelmia alukkeen synteesin laadussa. Toisella kahdesta alukkeesta on korkea pitoisuus ja toisella alhainen pitoisuus, mikä johtaa alhaiseen tehokkuuteen asymmetriseen monistukseen.

Vastatoimenpiteet ovat:

① Valitse hyvä alukkeen synteesiyksikkö.

② Alukkeiden konsentraatiossa ei pitäisi tarkastella vain OD-arvoa, vaan myös alukkeen kantaliuosta agaroosigeelielektroforeesia varten. Pohjustusnauhoja on oltava, ja kahden pohjustusnauhan kirkkauden tulee olla suunnilleen sama. Esimerkiksi yhdessä alukkeessa on nauha ja toisessa ei ole nauhaa. Liuskojen PCR saattaa epäonnistua tällä hetkellä, ja se tulisi ratkaista neuvottelemalla alukkeen synteesiyksikön kanssa. Jos toisen pohjamaalin vaaleus on korkea ja toisen matala, tasapainota pitoisuudet pohjusteita laimentaessasi.

③ Pohjusteet tulee säilyttää suuria pitoisuuksia ja pieniä määriä toistuvan jäätymisen ja sulamisen estämiseksi tai pitkäaikaisen säilytyksen jääkaapissa, mikä voi johtaa pohjusteiden huonontumiseen ja hajoamiseen.

④Alukesuunnittelu on kohtuuton, esim. alukkeen pituus ei ole riittävä, alukkeiden väliin muodostuu dimeerejä jne. Mg2+-pitoisuus: Mg2+-ionikonsentraatiolla on suuri vaikutus PCR-monistuksen tehokkuuteen. Jos pitoisuus on liian korkea, se voi heikentää PCR-monistuksen spesifisyyttä. Jos konsentraatio on liian alhainen, se vaikuttaa PCR-monistuksen saantoon ja jopa aiheuttaa PCR-monistuksen epäonnistumisen ilman monistuvia vyöhykkeitä. Muutokset reaktiotilavuudessa: Yleensä PCR-monistukseen käytetyt tilavuudet ovat 20 ul, 30 ul ja 50 ul. Tai 100ul, mikä tilavuus PCR-monistukseen tulee käyttää, asetetaan tieteellisen tutkimuksen ja kliinisen testauksen eri tarkoitusten mukaan. Kun olet tehnyt pienen määrän, kuten 20 ul, ja tehnyt sitten suuremman tilavuuden, sinun on noudatettava ehtoja, muuten se epäonnistuu helposti. Fyysiset syyt: Denaturaatio on erittäin tärkeä PCR-monistuksen kannalta. Jos denaturointilämpötila on alhainen ja denaturaatioaika lyhyt, vääriä negatiivisia esiintyy erittäin todennäköisimmin; hehkutuslämpötila on liian alhainen, mikä voi aiheuttaa epäspesifistä vahvistusta ja heikentää ominaisvahvistuksen tehokkuutta. Hehkutuslämpötila on liian korkea. Vaikuttaa voimakkaasti alukkeiden sitoutumiseen templaatteihin ja vähentää PCR-monistuksen tehokkuutta. Joskus on tarpeen käyttää tavallista lämpömittaria denaturaatio-, hehkutus- ja pidennyslämpötilan tarkistamiseen vahvistimessa tai vesiliukoisessa kattilassa. Tämä on myös yksi syy PCR:n epäonnistumiseen. Kohdesekvenssin variaatio: Jos kohdesekvenssi on mutatoitu tai deletoitu, mikä vaikuttaa alukkeen spesifiseen sitoutumiseen templaattiin, tai aluke ja templaatti menettävät komplementaarisen sekvenssin kohdesekvenssin tietyn segmentin deleetiosta johtuen, PCR-amplifikaatio ei onnistu.

2.väärä positiivinen Näkyvä PCR-amplifikaatiovyöhyke on yhdenmukainen kohdesekvenssivyöhykkeen kanssa, ja joskus vyöhyke on säännöllisempi ja kirkkaampi. Sopimaton alukesuunnittelu: Valitulla monistussekvenssillä on homologiaa ei-kohteena olevan monistussekvenssin kanssa, joten PCR-monistusta suoritettaessa monistettu PCR-tuote on ei-kohdesekvenssi. Jos kohdesekvenssi on liian lyhyt tai aluke on liian lyhyt, vääriä positiivisia voi esiintyä helposti. Pohjusteet on suunniteltava uudelleen. Kohdesekvenssien tai monistustuotteiden ristikontaminaatio: Tähän kontaminaatioon on kaksi syytä: Ensinnäkin koko genomin tai suurten fragmenttien ristikontaminaatio, joka johtaa vääriin positiivisiin tuloksiin. Tämä väärä positiivinen voidaan ratkaista seuraavilla menetelmillä: Ole varovainen ja varovainen käyttäessäsi, jotta kohdesekvenssi ei imeydy näytepistooliin tai roiskuisi ulos sentrifugiputkesta. Lukuun ottamatta entsyymejä ja aineita, jotka eivät kestä korkeita lämpötiloja, kaikki reagenssit tai laitteet tulee steriloida korkealla paineella. Kaikki sentrifugiputket ja näytteen injektiopipetin kärjet tulee käyttää kerran. Tarvittaessa reaktioputkia ja reagensseja säteilytetään ultraviolettivalolla ennen näytteen lisäämistä läsnä olevien nukleiinihappojen tuhoamiseksi. Toinen on pienten nukleiinihappofragmenttien saastuminen ilmassa. Nämä pienet fragmentit ovat lyhyempiä kuin kohdesekvenssi, mutta niillä on tietty homologia. Ne voidaan silmukoida toisiinsa, ja sen jälkeen kun ne ovat komplementaarisia alukkeille, PCR-tuotteet voidaan monistaa, mikä johtaa vääriin positiivisiin tuloksiin, joita voidaan vähentää tai poistaa sisäkkäisillä PCR-menetelmillä.

 

3. Epäspesifisiä vahvistusjuovia ilmestyy PCR-monistuksen jälkeen näkyvät juovat ovat epäjohdonmukaisia ​​odotetun koon kanssa, joko suurempia tai pienempiä, tai sekä spesifiset amplifikaatiovyöhykkeet että epäspesifiset amplifikaatiovyöhykkeet ilmestyvät samanaikaisesti. Epäspesifisten juovien ilmaantumisen syyt ovat: Ensinnäkin alukkeet eivät ole täysin komplementaarisia kohdesekvenssin kanssa tai alukkeet aggregoituvat muodostaen dimeerejä. Toinen syy on se, että Mg2+-ionipitoisuus on liian korkea, pariutumislämpötila on liian alhainen ja PCR-syklien määrä on liian suuri. Toinen tekijä on entsyymin laatu ja määrä. Joistakin lähteistä peräisin olevat entsyymit ovat usein alttiita epäspesifisille vyöhykkeille, mutta muista lähteistä peräisin olevat entsyymit eivät. Liialliset entsyymimäärät voivat joskus johtaa epäspesifiseen monistumiseen. Vastatoimia ovat: pohjusteiden uudelleensuunnittelu tarvittaessa. Vähennä entsyymin määrää tai korvaa se toisella lähteellä. Vähennä alukkeiden määrää, lisää mallineen määrää asianmukaisesti ja vähennä jaksojen määrää. Nosta hehkutuslämpötilaa sopivasti tai käytä kahden lämpötilapisteen menetelmää (denaturointi 93 °C:ssa, hehkutus ja pidennys noin 65 °C).

 

4. Hiutaleista tai tahroja esiintyy PCR-vahvistus näkyy joskus tahriintuneina juovina, arkkimaisina nauhoina tai mattomaisina juovina. Syyt johtuvat usein liiallisesta entsyymimäärästä tai entsyymin huonosta laadusta, liian korkeasta dNTP-pitoisuudesta, liian korkeasta Mg2+-pitoisuudesta, liian alhaisesta hehkutuslämpötilasta ja liian monista sykleistä. Vastatoimia ovat: ① Vähennä entsyymin määrää tai korvaa entsyymi toisella lähteellä. ② Pienennä dNTP:n pitoisuutta. Vähennä Mg2+-pitoisuutta asianmukaisesti. Lisää mallien määrää ja vähennä jaksojen määrää