PCR Ohiko galderak 1. Negatibo faltsuak, anplifikazio-bandarik ez da agertzen 2. Positibo faltsuak 3. Anplifikazio-bandak ez-espezifikoak agertzen dira 4. Arrastatze-banda malkatsuak edo lohi-bandak agertzen dira:

1Negatibo faltsua, ez da banda anplifikaturik agertzen PCR erreakzioaren funtsezko alderdiak hauek dira

① txantiloi azido nukleikoa prestatzea

② primer kalitatea eta espezifikotasuna

③ entzimaren kalitatea eta

④ PCR zikloaren baldintzak. Arrazoiak aurkitzeko, azterketa eta ikerketa ere egin behar dira goiko esteketan.

Txantiloia:

① Txantiloiak ezpurutasun-proteinak ditu

② Txantiloiak Taq entzimaren inhibitzaileak ditu

③ Txantiloiaren proteinak ez dira digeritzen eta kentzen, batez ere kromosometako histonak.

④ Txantiloia atera eta prestatzean gehiegi galdu zen edo fenola arnasten zen

⑤Azido nukleikoa txantiloia ez da guztiz desnaturalizatu. Entzimen eta abiarazleen kalitatea ona denean, anplifikazio-bandak agertzen ez badira, litekeena da laginaren digestio-prozesuan edo txantiloiaren azido nukleikoen erauzketa-prozesuan zerbait gaizki egotea. Horregatik, digestio-soluzio eraginkor eta egonkorra prestatu behar da, eta prozedura konpondu behar da eta ez da nahierara aldatu behar. . Entzimaren inaktibazioa: beharrezkoa da entzima berria ordezkatzea, edo aldi berean entzima zaharrak eta berriak erabiltzea negatibo faltsuak galtzeak edo entzimaren jarduera nahikoa eskasak eragiten dituen aztertzeko. Kontuan izan behar da batzuetan Taq entzima ahazten dela.Primerak: Primer-kalitatea, primer-kontzentrazioa eta bi abiarazleen kontzentrazioak simetrikoak diren ala ez, PCRren hutsegite edo anplifikazio-banda desegokiak eta difusio errazaren arrazoi ohikoak dira. Lote batzuetan lehen sintesiaren kalitatearekin arazoak daude. Bi primeretako batek kontzentrazio handia du eta besteak kontzentrazio baxua du, eta ondorioz eraginkortasun baxuko anplifikazio asimetrikoa da.

Kontraneurriak hauek dira:

① Hautatu lehen-sintesi-unitate on bat.

② Primeren kontzentrazioa ez da soilik OD balioa begiratu behar, baizik eta agarosa gel elektroforesirako lehen stock-soluzioari ere arreta jarri behar. Primer-bandak egon behar dira, eta bi primer-banden distira gutxi gorabehera berdina izan behar da. Esate baterako, primer batek banda bat du eta besteak ez du bandarik. Bandetan, PCRk huts egin dezake une honetan eta lehen sintesi unitatearekin negoziatuz konpondu behar da. Primer batek distira handia badu eta besteak distira baxua badu, orekatu kontzentrazioak lehengaiak diluitzean.

③ Primerak kontzentrazio handian eta kantitate txikietan gorde behar dira behin eta berriz izozteak eta desizozteak edo hozkailuan epe luzera biltegiratzea saihesteko, eta horrek lehengaiak hondatzea eta degradatzea ekar dezake.

④Primeraren diseinua ez da arrazoizkoa, adibidez, hasierako luzera ez da nahikoa, dimeroak abiarazteen artean sortzen dira, etab. Mg2+ kontzentrazioa: Mg2+ ioien kontzentrazioa PCR anplifikazioaren eraginkortasunean eragin handia du. Kontzentrazioa altuegia bada, PCR anplifikazioaren espezifikotasuna murriztu dezake. Kontzentrazioa baxuegia bada, PCR anplifikazioaren errendimenduari eragingo dio eta PCR anplifikazioa banda anplifikatu gabe huts egitea ere eragingo du. Erreakzio bolumenaren aldaketak: normalean PCR anplifikaziorako erabiltzen diren bolumenak 20ul, 30ul eta 50ul dira. Edo 100ul, PCR anplifikaziorako zer bolumen erabili behar den ikerketa zientifikoen eta proba klinikoen helburu ezberdinen arabera ezartzen da. Bolumen txiki bat egin ondoren, adibidez, 20ul, eta gero bolumen handiagoa egin ondoren, baldintzak jarraitu behar dituzu, bestela erraz huts egingo du. Arrazoi fisikoak: desnaturalizazioa oso garrantzitsua da PCR anplifikaziorako. Desnaturalizazio tenperatura baxua bada eta desnaturalizazio denbora laburra bada, oso litekeena da negatibo faltsuak gertatzea; annealing-tenperatura baxuegia da, eta horrek anplifikazio ez-espezifikoa eragin dezake eta anplifikazio espezifikoaren eraginkortasuna murrizten du. Errekuzitzeko tenperatura altuegia da. Eragin handia du abiarazleak txantiloiekin lotzea eta PCR anplifikazioaren eraginkortasuna murrizten du. Batzuetan, beharrezkoa da termometro estandar bat erabiltzea anplifikadorea edo ur-disolbagarria den ontzian desnaturalizazio, errekuzitu eta hedatze tenperaturak egiaztatzeko. Hau ere PCR porrotaren arrazoietako bat da. Helburu-sekuentziaren aldakuntza: xede-sekuentzia mutatuta edo ezabatzen bada, eta horrek abiarazlearen txantiloiarekiko lotura espezifikoa eragiten badu, edo abiarazleak eta txantiloiak sekuentzia osagarria galtzen badute xede-sekuentziaren segmentu jakin bat ezabatzearen ondorioz, PCR anplifikazioa. ez du arrakastarik izango.

2.positibo faltsua Agertzen den PCR anplifikazio-banda xede-sekuentzia-bandarekin bat dator, eta batzuetan banda ordenatuagoa eta distiratsuagoa da. Primer-diseinu desegokia: hautatutako anplifikazio-sekuentziak homologia du xede ez den anplifikazio-sekuentziarekin, beraz, PCR anplifikazioa egitean, anplifikatutako PCR produktua xede ez den sekuentzia bat da. Helburu-sekuentzia laburregia bada edo abiarazlea laburregia bada, positibo faltsuak erraz gerta daitezke. Primerak birdiseinatu behar dira. Xede-sekuentzien edo anplifikazio-produktuen gurutzaketa kutsadura: Bi arrazoi daude kutsadura hori: Lehenengoa, genoma osoaren edo zati handien kutsadura gurutzatua, positibo faltsuak eraginez. Positibo faltsu hau metodo hauen bidez ebatzi daiteke: Kontuz ibili eta emeki jarduten duzunean xede-sekuentzia lagin-pistolan zurrupatu edo zentrifuga-hoditik zipriztindu ez dadin. Tenperatura altuak jasan ezin dituzten entzimak eta substantziak izan ezik, erreaktibo edo ekipamendu guztiak presio handiko esterilizatu behar dira. Zentrifuga-hodi guztiak eta laginak injekzio-pipetaren puntak behin erabili behar dira. Beharrezkoa bada, erreakzio-hodiak eta erreaktiboak argi ultramorearekin irradiatzen dira alea gehitu aurretik, dauden azido nukleikoak suntsitzeko. Bigarrena, airean dauden azido nukleiko zati txikien kutsadura da. Zati txiki hauek xede-sekuentzia baino laburragoak dira, baina nolabaiteko homologia dute. Elkarren artean spliz daitezke, eta abiarazteen osagarri izan ondoren, PCR produktuak anplifikatu daitezke, positibo faltsuak eraginez, eta PCR habiaraturiko metodoen bidez murriztu edo ezaba daitezke.

 

3.Anplifikazio-banda ez-espezifikoak agertzen dira PCR-aren anplifikazioaren ondoren agertzen diren bandak ez datoz bat espero den tamainarekin, handiagoak edo txikiagoak, edo anplifikazio-banda espezifikoak eta anplifikazio-banda ez-espezifikoak aldi berean agertzen dira. Banda ez-espezifikoak agertzearen arrazoiak hauek dira: lehenik, abiarazleak ez dira xede-sekuentziaren guztiz osagarriak, edo abiarazleak batu egiten dira dimeroak sortzeko. Bigarren arrazoia hauxe da: Mg2+ ioien kontzentrazioa altuegia dela, annealing tenperatura baxuegia dela eta PCR zikloen kopurua altuegia dela. Bigarren faktorea entzimaren kalitatea eta kantitatea da. Iturri batzuetako entzimek banda ez-espezifikoak izateko joera izaten dute, baina beste iturri batzuetako entzimek ez. Gehiegizko entzima kopuruek anplifikazio ez-espezifikoa ekar dezakete batzuetan. Kontraneurriek honako hauek dira: behar izanez gero, inprimagailuak birdiseinatzea. Murriztu entzima kopurua edo ordezkatu beste iturri batekin. Murriztu lehen-kopurua, handitu txantiloi-kopurua egokiro eta murriztu ziklo-kopurua. Igotzeko tenperatura egokiro handitu edo bi tenperatura puntuko metodoa erabili (desnaturalizazioa 93 °C-tan, annealing eta luzapena 65 °C inguruan).

 

4.Flaky arrastatu edo smears agertzen PCR anplifikazioa batzuetan smeared banda gisa agertzen da, xafla-itxurako bandak edo alfonbra-itxurako banda gisa. Arrazoiak sarritan entzima gehiegi edo entzimaren kalitate eskasak, dNTP kontzentrazio altuegiak, Mg2+ kontzentrazio altuegiak, annealing-tenperatura baxuegiak eta ziklo gehiegik eragiten dituzte. Kontraneurrien artean honako hauek daude: ① Entzima-kopurua murriztea edo ordezkatu entzima beste iturri batekin. ② Murriztu dNTPren kontzentrazioa. Mg2+ kontzentrazioa behar bezala murriztu. Handitu txantiloien kopurua eta murriztu ziklo kopurua