Preguntas frecuentes sobre PCR 1. Falso negativo, no aparece ninguna banda de amplificación 2. Falso positivo 3. Aparecen bandas de amplificación no específicas 4. Aparecen tiras de arrastre o frotis escamosas:

1Falso negativo, no aparece ninguna banda amplificada Los aspectos clave de la reacción de PCR son

① preparación de ácido nucleico plantilla

② calidad y especificidad del cebador

③ calidad de la enzima y

④ Condiciones del ciclo de PCR. Para encontrar las razones, también se deben realizar análisis e investigaciones en los enlaces anteriores.

Plantilla:

① La plantilla contiene proteínas impurezas.

② La plantilla contiene inhibidores de la enzima Taq.

③ Las proteínas de la plantilla no se digieren ni se eliminan, especialmente las histonas de los cromosomas.

④ Se perdió demasiado durante la extracción y preparación de la plantilla, o se inhaló fenol.

⑤El ácido nucleico plantilla no está completamente desnaturalizado. Cuando la calidad de las enzimas y los cebadores es buena, si no aparecen bandas de amplificación, lo más probable es que haya algún problema con el proceso de digestión de la muestra o con el proceso de extracción del ácido nucleico plantilla. Por lo tanto, se debe preparar una solución de digestión eficaz y estable, y el procedimiento debe fijarse y no modificarse a voluntad. . Inactivación de enzimas: es necesario reemplazar la nueva enzima o usar enzimas nuevas y antiguas al mismo tiempo para analizar si los falsos negativos se deben a una pérdida o una actividad enzimática insuficiente. Cabe señalar que a veces se olvida la enzima Taq. Cebadores: la calidad del cebador, la concentración del cebador y si las concentraciones de los dos cebadores son simétricas son razones comunes para el fallo de la PCR o bandas de amplificación insatisfactorias y fácil difusión. Existen problemas con la calidad de la síntesis de cebadores en algunos lotes. Uno de los dos cebadores tiene una concentración alta y el otro tiene una concentración baja, lo que resulta en una amplificación asimétrica de baja eficiencia.

Las contramedidas son:

① Seleccione una buena unidad de síntesis de cebadores.

② La concentración de los cebadores no solo debe tener en cuenta el valor de DO, sino también prestar atención a la solución madre del cebador para la electroforesis en gel de agarosa. Debe haber bandas de cebador y el brillo de las dos bandas de cebador debe ser aproximadamente el mismo. Por ejemplo, un cebador tiene una banda y el otro cebador no tiene banda. Para las tiras, la PCR puede fallar en este momento y debe resolverse mediante negociación con la unidad de síntesis de cebadores. Si una imprimación tiene un brillo alto y la otra tiene un brillo bajo, equilibre las concentraciones al diluir las imprimaciones.

③ Los imprimadores deben almacenarse en altas concentraciones y en pequeñas cantidades para evitar la congelación y descongelación repetidas o el almacenamiento prolongado en el refrigerador, lo que puede provocar el deterioro y la degradación de los imprimadores.

④El diseño del cebador no es razonable, como que la longitud del cebador no es suficiente, se forman dímeros entre los cebadores, etc. Concentración de Mg2+: la concentración de iones Mg2+ tiene una gran influencia en la eficiencia de la amplificación por PCR. Si la concentración es demasiado alta, puede reducir la especificidad de la amplificación por PCR. Si la concentración es demasiado baja, afectará el rendimiento de la amplificación por PCR e incluso hará que la amplificación por PCR falle sin amplificar las bandas. Cambios en el volumen de reacción: normalmente los volúmenes utilizados para la amplificación por PCR son 20 ul, 30 ul y 50 ul. O 100ul, el volumen que se debe utilizar para la amplificación por PCR se establece según los diferentes propósitos de la investigación científica y las pruebas clínicas. Después de hacer un volumen pequeño, como 20 ul, y luego hacer un volumen mayor, debe seguir las condiciones; de lo contrario, fallará fácilmente. Razones físicas: la desnaturalización es muy importante para la amplificación por PCR. Si la temperatura de desnaturalización es baja y el tiempo de desnaturalización es corto, es muy probable que se produzcan falsos negativos; la temperatura de recocido es demasiado baja, lo que puede provocar una amplificación no específica y reducir la eficiencia de la amplificación específica. La temperatura de recocido es demasiado alta. Afecta en gran medida la unión de los cebadores a las plantillas y reduce la eficiencia de la amplificación por PCR. En ocasiones es necesario utilizar un termómetro estándar para comprobar las temperaturas de desnaturalización, recocido y extensión en el amplificador o recipiente soluble en agua. Esta es también una de las razones del fracaso de la PCR. Variación de la secuencia objetivo: si la secuencia objetivo está mutada o eliminada, lo que afecta la unión específica del cebador a la plantilla, o si el cebador y la plantilla pierden la secuencia complementaria debido a la eliminación de un determinado segmento de la secuencia objetivo, la amplificación por PCR no tendrá éxito.

2.falso positivo La banda de amplificación por PCR que aparece es consistente con la banda de la secuencia objetivo y, a veces, la banda es más ordenada y brillante. Diseño de cebador inadecuado: la secuencia de amplificación seleccionada tiene homología con la secuencia de amplificación no objetivo, por lo que al realizar la amplificación por PCR, el producto de PCR amplificado es una secuencia no objetivo. Si la secuencia objetivo es demasiado corta o el cebador es demasiado corto, es fácil que se produzcan falsos positivos. Es necesario rediseñar los cebadores. Contaminación cruzada de secuencias objetivo o productos de amplificación: Hay dos razones para esta contaminación: en primer lugar, la contaminación cruzada de todo el genoma o de fragmentos grandes, que conduce a falsos positivos. Este falso positivo se puede resolver mediante los siguientes métodos: Sea cuidadoso y cuidadoso al operar para evitar que la secuencia objetivo sea succionada por la pistola de muestra o salpicada del tubo de centrífuga. A excepción de las enzimas y sustancias que no pueden soportar altas temperaturas, todos los reactivos o equipos deben esterilizarse mediante alta presión. Todos los tubos de centrífuga y las puntas de pipetas de inyección de muestras deben usarse una vez. Si es necesario, los tubos de reacción y los reactivos se irradian con luz ultravioleta antes de añadir la muestra para destruir los ácidos nucleicos presentes. El segundo es la contaminación de pequeños fragmentos de ácidos nucleicos en el aire. Estos pequeños fragmentos son más cortos que la secuencia diana, pero tienen cierta homología. Se pueden empalmar entre sí y, después de ser complementarios de los cebadores, los productos de la PCR se pueden amplificar, lo que da como resultado falsos positivos, que se pueden reducir o eliminar mediante métodos de PCR anidados.

 

3.Aparecen bandas de amplificación no específicas Las bandas que aparecen después de la amplificación por PCR no coinciden con el tamaño esperado, ya sea más grandes o más pequeñas, o aparecen ambas bandas de amplificación específicas y no específicas al mismo tiempo. Las razones de la aparición de bandas no específicas son: en primer lugar, los cebadores no son completamente complementarios a la secuencia diana, o los cebadores se agregan para formar dímeros. La segunda razón es que la concentración de iones Mg2+ es demasiado alta, la temperatura de recocido es demasiado baja y el número de ciclos de PCR es demasiado alto. El segundo factor es la calidad y cantidad de la enzima. Las enzimas de algunas fuentes suelen ser propensas a formar bandas no específicas, pero las enzimas de otras fuentes no. Cantidades excesivas de enzimas a veces pueden provocar una amplificación no específica. Las contramedidas incluyen: rediseñar los cebadores si es necesario. Reduzca la cantidad de enzima o reemplácela con otra fuente. Reduzca la cantidad de cebadores, aumente la cantidad de plantilla de manera adecuada y reduzca el número de ciclos. Aumente la temperatura de recocido adecuadamente o utilice el método de dos puntos de temperatura (desnaturalización a 93 °C, recocido y extensión alrededor de 65 °C).

 

4.Aparecen manchas o arrastre escamoso. La amplificación por PCR a veces aparece como bandas manchadas, bandas en forma de lámina o bandas en forma de alfombra. Las razones a menudo son causadas por demasiada enzima o mala calidad de la enzima, una concentración demasiado alta de dNTP, una concentración demasiado alta de Mg2+, una temperatura de recocido demasiado baja y demasiados ciclos. Las contramedidas incluyen: ① Reducir la cantidad de enzima o reemplazar la enzima con otra fuente. ②Reducir la concentración de dNTP. Reducir adecuadamente la concentración de Mg2+. Aumentar la cantidad de plantillas y reducir el número de ciclos.