Ο διαχωρισμός και ο καθαρισμός των πρωτεϊνών χρησιμοποιείται ευρέως στην έρευνα και την εφαρμογή της βιοχημείας και είναι μια σημαντική επιχειρησιακή δεξιότητα. Ένα τυπικό ευκαρυωτικό κύτταρο μπορεί να περιέχει χιλιάδες διαφορετικές πρωτεΐνες, μερικές είναι πολύ πλούσιες και άλλες περιέχουν μόνο λίγα αντίγραφα. Προκειμένου να μελετήσει ένα ορισμένοπρωτεΐνη, είναι απαραίτητο να καθαριστεί πρώτα η πρωτεΐνη από άλλες πρωτεΐνες και μη πρωτεϊνικά μόρια.

1. Μέθοδος αλατίσματοςπρωτεΐνη:

Το ουδέτερο αλάτι έχει σημαντική επίδραση στη διαλυτότητα της πρωτεΐνης. Γενικά, με την αύξηση της συγκέντρωσης άλατος σε χαμηλή συγκέντρωση άλατος, η διαλυτότητα της πρωτεΐνης αυξάνεται. Αυτό ονομάζεται αλάτισμα. όταν η συγκέντρωση του αλατιού συνεχίζει να αυξάνεται, η διαλυτότητα της πρωτεΐνης μειώνεται σε διάφορους βαθμούς και διαχωρίζεται η μία μετά την άλλη. Αυτό το φαινόμενο ονομάζεται αλάτισμα.

2. Μέθοδος στοίβαξης ισοηλεκτρικών σημείων:

Η ηλεκτροστατική απώθηση μεταξύ των σωματιδίων είναι η μικρότερη όταν η πρωτεΐνη είναι στατική, επομένως η διαλυτότητα είναι επίσης η μικρότερη. Τα ισοηλεκτρικά σημεία των διαφόρων πρωτεϊνών είναι διαφορετικά. Το pH του ρυθμιστικού διαλύματος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επίτευξη του ισοηλεκτρικού σημείου μιας πρωτεΐνης για να συσσωρευτεί, αλλά αυτή η μέθοδος σπάνια χρησιμοποιείται μόνη της και μπορεί να συνδυαστεί με τη μέθοδο αλατοποίησης.

3. Αιμοκάθαρση και υπερδιήθηση:

Η αιμοκάθαρση χρησιμοποιεί μια ημιπερατή μεμβράνη για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών διαφορετικών μοριακών μεγεθών. Η μέθοδος υπερδιήθησης χρησιμοποιεί υψηλή πίεση ή φυγόκεντρο δύναμη για να κάνει το νερό και άλλα μικρά μόρια διαλυμένης ουσίας να περάσουν μέσα από μια ημιπερατή μεμβράνη, ενώ ηπρωτεΐνηπαραμένει στη μεμβράνη. Μπορείτε να επιλέξετε διαφορετικά μεγέθη πόρων για να αναχαιτίσετε πρωτεΐνες διαφορετικού μοριακού βάρους.

4. Μέθοδος φιλτραρίσματος γέλης:

Ονομάζεται επίσης χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους ή χρωματογραφία μοριακού κόσκινου, αυτή είναι μια από τις πιο χρήσιμες μεθόδους για τον διαχωρισμό πρωτεϊνικών μιγμάτων ανάλογα με το μοριακό μέγεθος. Τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα υλικά συσκευασίας στη στήλη είναι η γέλη γλυκόζης (Sephadex ged) και η γέλη αγαρόζης (γέλη αγαρόζης).

5.Ηλεκτροφόρηση:

Κάτω από τις ίδιες συνθήκες pH, διάφορες πρωτεΐνες μπορούν να διαχωριστούν λόγω του διαφορετικού μοριακού τους βάρους και των διαφορετικών φορτίων στο ηλεκτρικό πεδίο. Αξίζει να δοθεί προσοχή στην ηλεκτροφόρηση ισοηλεκτρικού σετ, η οποία χρησιμοποιεί έναν αμφολύτη ως φορέα. Κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης, ο αμφολύτης σχηματίζει μια βαθμίδα pH που προστίθεται σταδιακά από το θετικό ηλεκτρόδιο στο αρνητικό ηλεκτρόδιο. Όταν η πρωτεΐνη με ένα συγκεκριμένο φορτίο κολυμπήσει μέσα της, θα φτάσει η μία στην άλλη. Η θέση pH του ηλεκτρικού σημείου είναι ασυνεχής και αυτή η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση και την παρασκευή διαφόρων πρωτεϊνών.

6. Χρωματογραφία επικοινωνίας ιόντων:

Οι παράγοντες επικοινωνίας ιόντων περιλαμβάνουν κατιονικούς παράγοντες επικοινωνίας (όπως καρβοξυμεθυλοκυτταρίνη· CM-κυτταρίνη) και ανιονικούς παράγοντες επικοινωνίας (διαιθυλαμινοαιθυλοκυτταρίνη). Όταν διέρχεται από τη στήλη χρωματογραφίας επικοινωνίας ιόντων, η πρωτεΐνη με το αντίθετο φορτίο από τον παράγοντα επικοινωνίας ιόντων προσροφάται στον παράγοντα επικοινωνίας ιόντων και στη συνέχεια η προσροφημένηπρωτεΐνηεκλούεται αλλάζοντας το pH ή την ιοντική ισχύ.

7.Χρωματογραφία συγγένειας:

Η χρωματογραφία συγγένειας είναι μια εξαιρετικά χρήσιμη μέθοδος για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών. Συχνά απαιτείται μόνο ένα βήμα για να διαχωριστεί μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη που θα καθαριστεί από ένα ακατάστατο μείγμα πρωτεϊνών με υψηλή καθαρότητα.

Αυτή η μέθοδος βασίζεται στην ειδική και όχι στην ομοιοπολική σύνδεση ορισμένων πρωτεϊνών σε ένα άλλο μόριο που ονομάζεται συνδέτης (Ligand).

Η βασική αρχή:

Οι πρωτεΐνες υπάρχουν σε ένα ακατάστατο μείγμα σε ιστούς ή κύτταρα και κάθε τύπος κυττάρου περιέχει χιλιάδες διαφορετικές πρωτεΐνες. Ως εκ τούτου, η διάκριση μεταξύ των πρωτεϊνών είναι ένα σημαντικό μέρος της βιοχημείας, και δεν ήταν μόνη της. Ή ένα σύνολο έτοιμων μεθόδων μπορεί να αφαιρέσει οποιοδήποτε είδος πρωτεΐνης από μια ακατάστατη μικτή πρωτεΐνη, επομένως πολλές μέθοδοι χρησιμοποιούνται συχνά σε συνδυασμό.