Συχνές ερωτήσεις PCR 1. Εσφαλμένα αρνητικά, δεν εμφανίζεται ζώνη ενίσχυσης 2. Ψευδής θετική 3. Εμφανίζονται μη ειδικές ζώνες ενίσχυσης 4. Εμφανίζονται λωρίδες ολίσθησης ή λωρίδες κηλίδωσης:

1 Ψευδώς αρνητικό, δεν εμφανίζεται ενισχυμένη ζώνη Οι βασικές πτυχές της αντίδρασης PCR είναι

① προετοιμασία του προτύπου νουκλεϊκού οξέος

② Ποιότητα και ειδικότητα ασταριού

③ ποιότητα ενζύμου και

④ Συνθήκες κύκλου PCR. Για να βρεθούν οι λόγοι, θα πρέπει να γίνει ανάλυση και έρευνα στους παραπάνω συνδέσμους.

Περίγραμμα:

① Το πρότυπο περιέχει πρωτεΐνες ακαθαρσιών

② Το πρότυπο περιέχει αναστολείς ενζύμου Taq

③ Οι πρωτεΐνες στο πρότυπο δεν χωνεύονται και δεν αφαιρούνται, ειδικά οι ιστόνες στα χρωμοσώματα

④ Χάθηκε πάρα πολύ κατά την εκχύλιση και την προετοιμασία του προτύπου ή εισπνέεται φαινόλη

⑤Το εκμαγείο νουκλεϊκού οξέος δεν είναι πλήρως μετουσιωμένο. Όταν η ποιότητα των ενζύμων και των εκκινητών είναι καλή, εάν δεν εμφανίζονται ζώνες ενίσχυσης, είναι πολύ πιθανό να υπάρχει κάτι λάθος με τη διαδικασία πέψης του δείγματος ή τη διαδικασία εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος του προτύπου. Επομένως, πρέπει να παρασκευαστεί ένα αποτελεσματικό και σταθερό διάλυμα πέψης και η διαδικασία θα πρέπει να διορθωθεί και να μην αλλάξει κατά βούληση. . Απενεργοποίηση ενζύμου: Είναι απαραίτητο να αντικαταστήσετε το νέο ένζυμο ή να χρησιμοποιήσετε και τα παλιά και τα νέα ένζυμα ταυτόχρονα για να αναλύσετε εάν τα ψευδώς αρνητικά προκαλούνται από απώλεια ή ανεπαρκή ενζυμική δραστηριότητα. Πρέπει να σημειωθεί ότι μερικές φορές το ένζυμο Taq ξεχνιέται. Εκκινητές: Ποιότητα εκκινητών, συγκέντρωση εκκινητών και αν οι συγκεντρώσεις των δύο εκκινητών είναι συμμετρικές είναι συνήθεις λόγοι για αποτυχία της PCR ή μη ικανοποιητικές ζώνες ενίσχυσης και εύκολη διάχυση. Υπάρχουν προβλήματα με την ποιότητα της σύνθεσης ασταριού σε ορισμένες παρτίδες. Ο ένας από τους δύο εκκινητές έχει υψηλή συγκέντρωση και ο άλλος χαμηλή συγκέντρωση, με αποτέλεσμα ασύμμετρη ενίσχυση χαμηλής απόδοσης.

Τα αντίμετρα είναι:

① Επιλέξτε μια καλή μονάδα σύνθεσης ασταριού.

② Η συγκέντρωση των εκκινητών δεν πρέπει να εξετάζει μόνο την τιμή OD, αλλά και να δίνει προσοχή στο αποθεματικό διάλυμα ασταριού για ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης. Πρέπει να υπάρχουν λωρίδες ασταριού και η φωτεινότητα των δύο λωρίδων ασταριού πρέπει να είναι περίπου η ίδια. Για παράδειγμα, το ένα αστάρι έχει ταινία και το άλλο αστάρι δεν έχει ταινία. Για τις ταινίες, η PCR μπορεί να αποτύχει αυτή τη στιγμή και θα πρέπει να επιλυθεί μέσω διαπραγμάτευσης με τη μονάδα σύνθεσης εκκινητών. Εάν το ένα αστάρι έχει υψηλή φωτεινότητα και το άλλο έχει χαμηλή φωτεινότητα, ισορροπήστε τις συγκεντρώσεις κατά την αραίωση των ασταριών.

③ Τα αστάρια θα πρέπει να αποθηκεύονται σε υψηλή συγκέντρωση και μικρές ποσότητες για να αποφευχθεί η επαναλαμβανόμενη κατάψυξη και απόψυξη ή η μακροχρόνια αποθήκευση στο ψυγείο, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε φθορά και υποβάθμιση των ασταριών.

④ Ο σχεδιασμός του εκκινητή δεν είναι λογικός, καθώς το μήκος του εκκινητή δεν είναι αρκετό, σχηματίζονται διμερή μεταξύ των εκκινητών κ.λπ. Συγκέντρωση Mg2+: Η συγκέντρωση ιόντων Mg2+ έχει μεγάλη επίδραση στην αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης PCR. Εάν η συγκέντρωση είναι πολύ υψηλή, μπορεί να μειώσει την ειδικότητα της ενίσχυσης PCR. Εάν η συγκέντρωση είναι πολύ χαμηλή, θα επηρεάσει την απόδοση ενίσχυσης PCR και ακόμη και θα προκαλέσει την αποτυχία της ενίσχυσης PCR χωρίς να ενισχυθούν οι ζώνες. Αλλαγές στον όγκο αντίδρασης: Συνήθως οι όγκοι που χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση PCR είναι 20 ul, 30 ul και 50 ul. Ή 100 ul, ο όγκος που πρέπει να χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση PCR ορίζεται σύμφωνα με διαφορετικούς σκοπούς επιστημονικής έρευνας και κλινικών δοκιμών. Αφού φτιάξετε έναν μικρό όγκο, όπως 20ul, και μετά κάνετε μεγαλύτερο όγκο, πρέπει να ακολουθήσετε τις συνθήκες, διαφορετικά θα αποτύχει εύκολα. Φυσικοί λόγοι: Η μετουσίωση είναι πολύ σημαντική για την ενίσχυση PCR. Εάν η θερμοκρασία μετουσίωσης είναι χαμηλή και ο χρόνος μετουσίωσης είναι σύντομος, είναι πολύ πιθανό να προκύψουν ψευδώς αρνητικά. η θερμοκρασία ανόπτησης είναι πολύ χαμηλή, γεγονός που μπορεί να προκαλέσει μη ειδική ενίσχυση και να μειώσει την ειδική απόδοση ενίσχυσης. Η θερμοκρασία ανόπτησης είναι πολύ υψηλή. Επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό τη σύνδεση των εκκινητών με τα εκμαγεία και μειώνει την αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης PCR. Μερικές φορές είναι απαραίτητο να χρησιμοποιήσετε ένα τυπικό θερμόμετρο για να ελέγξετε τις θερμοκρασίες μετουσίωσης, ανόπτησης και επέκτασης στον ενισχυτή ή στο υδατοδιαλυτό δοχείο. Αυτός είναι επίσης ένας από τους λόγους για την αποτυχία της PCR. Παραλλαγή αλληλουχίας στόχου: Εάν η αλληλουχία στόχος έχει μεταλλαχθεί ή διαγραφεί, γεγονός που επηρεάζει την ειδική δέσμευση του εκκινητή με το εκμαγείο ή ο εκκινητής και το πρότυπο χάνουν τη συμπληρωματική αλληλουχία λόγω της διαγραφής ενός συγκεκριμένου τμήματος της αλληλουχίας στόχου, η ενίσχυση PCR δεν θα έχει επιτυχία.

2.ψευδώς θετικό Η ζώνη ενίσχυσης PCR που εμφανίζεται είναι συνεπής με τη ζώνη αλληλουχίας στόχου και μερικές φορές η ζώνη είναι πιο τακτική και φωτεινότερη. Ακατάλληλη σχεδίαση εκκινητών: Η επιλεγμένη αλληλουχία ενίσχυσης έχει ομολογία με την αλληλουχία ενίσχυσης μη στόχου, επομένως κατά την εκτέλεση ενίσχυσης PCR, το ενισχυμένο προϊόν PCR είναι μια αλληλουχία μη στόχου. Εάν η αλληλουχία στόχος είναι πολύ μικρή ή ο εκκινητής είναι πολύ μικρός, μπορεί εύκολα να προκύψουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Τα αστάρια πρέπει να επανασχεδιαστούν. Διασταυρούμενη μόλυνση αλληλουχιών στόχων ή προϊόντων ενίσχυσης: Υπάρχουν δύο λόγοι για αυτή τη μόλυνση: Πρώτον, διασταυρούμενη μόλυνση ολόκληρου του γονιδιώματος ή μεγάλων θραυσμάτων, που οδηγεί σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Αυτό το ψευδώς θετικό μπορεί να λυθεί με τις ακόλουθες μεθόδους: Να είστε προσεκτικοί και ήπιοι κατά τη λειτουργία για να αποτρέψετε την αναρρόφηση της αλληλουχίας στόχου στο πιστόλι δείγματος ή την εκτόξευση από το σωλήνα φυγοκέντρησης. Εκτός από ένζυμα και ουσίες που δεν αντέχουν σε υψηλές θερμοκρασίες, όλα τα αντιδραστήρια ή ο εξοπλισμός θα πρέπει να αποστειρώνονται με υψηλή πίεση. Όλοι οι σωλήνες φυγοκέντρησης και τα άκρα της πιπέτας έγχυσης δείγματος θα πρέπει να χρησιμοποιούνται μία φορά. Εάν είναι απαραίτητο, οι σωλήνες αντίδρασης και τα αντιδραστήρια ακτινοβολούνται με υπεριώδες φως πριν από την προσθήκη του δείγματος για να καταστραφούν τα νουκλεϊκά οξέα που υπάρχουν. Το δεύτερο είναι η μόλυνση μικρών θραυσμάτων νουκλεϊκών οξέων στον αέρα. Αυτά τα μικρά θραύσματα είναι μικρότερα από την αλληλουχία στόχο, αλλά έχουν ορισμένη ομολογία. Μπορούν να συνδεθούν μεταξύ τους και αφού γίνουν συμπληρωματικά με τους εκκινητές, τα προϊόντα PCR μπορούν να ενισχυθούν, καταλήγοντας σε ψευδώς θετικά, τα οποία μπορούν να μειωθούν ή να εξαλειφθούν με μεθόδους ένθετης PCR.

 

3. Εμφανίζονται μη ειδικές ζώνες ενίσχυσης Οι ζώνες που εμφανίζονται μετά την ενίσχυση PCR δεν συνάδουν με το αναμενόμενο μέγεθος, είτε μεγαλύτερες είτε μικρότερες, ή εμφανίζονται ταυτόχρονα και οι δύο συγκεκριμένες ζώνες ενίσχυσης και οι μη ειδικές ζώνες ενίσχυσης. Οι λόγοι για την εμφάνιση μη ειδικών ζωνών είναι: πρώτον, οι εκκινητές δεν είναι πλήρως συμπληρωματικοί με την αλληλουχία στόχο ή οι εκκινητές συσσωματώνονται για να σχηματίσουν διμερή. Ο δεύτερος λόγος είναι ότι η συγκέντρωση ιόντων Mg2+ είναι πολύ υψηλή, η θερμοκρασία ανόπτησης είναι πολύ χαμηλή και ο αριθμός των κύκλων PCR είναι πολύ υψηλός. Ο δεύτερος παράγοντας είναι η ποιότητα και η ποσότητα του ενζύμου. Τα ένζυμα από ορισμένες πηγές είναι συχνά επιρρεπή σε μη ειδικές ζώνες, αλλά τα ένζυμα από άλλες πηγές δεν το κάνουν. Οι υπερβολικές ποσότητες ενζύμων μπορεί μερικές φορές να οδηγήσουν σε μη ειδική ενίσχυση. Τα αντίμετρα περιλαμβάνουν: επανασχεδιασμό ασταριών εάν είναι απαραίτητο. Μειώστε την ποσότητα του ενζύμου ή αντικαταστήστε το με άλλη πηγή. Μειώστε την ποσότητα των εκκινητών, αυξήστε την ποσότητα του προτύπου κατάλληλα και μειώστε τον αριθμό των κύκλων. Αυξήστε τη θερμοκρασία ανόπτησης κατάλληλα ή χρησιμοποιήστε τη μέθοδο σημείων δύο θερμοκρασιών (μετουσίωσης στους 93°C, ανόπτηση και επέκταση γύρω στους 65°C).

 

4. Εμφανίζονται λεπιώδη έλξη ή κηλίδες Η ενίσχυση PCR εμφανίζεται μερικές φορές ως κηλιδωμένες ταινίες, ταινίες που μοιάζουν με φύλλο ή ταινίες σαν χαλί. Οι λόγοι προκαλούνται συχνά από υπερβολική ποσότητα ενζύμου ή κακή ποιότητα ενζύμου, πολύ υψηλή συγκέντρωση dNTP, πολύ υψηλή συγκέντρωση Mg2+, πολύ χαμηλή θερμοκρασία ανόπτησης και πάρα πολλούς κύκλους. Τα αντίμετρα περιλαμβάνουν: ① Μειώστε την ποσότητα του ενζύμου ή αντικαταστήστε το ένζυμο με άλλη πηγή. ②Μειώστε τη συγκέντρωση του dNTP. Μειώστε κατάλληλα τη συγκέντρωση Mg2+. Αυξήστε τον αριθμό των προτύπων και μειώστε τον αριθμό των κύκλων