PCR-FAQ 1. Falsch negativ, keine Amplifikationsbande erscheint 2. Falsch positiv 3. Es erscheinen unspezifische Amplifikationsbanden 4. Es erscheinen schuppige Schleppstreifen oder Schmierstreifen:
1Falsch negativ, es erscheint keine verstärkte Bande. Die Schlüsselaspekte der PCR-Reaktion sind
① Vorbereitung der Template-Nukleinsäure
② Primerqualität und -spezifität
③ Enzymqualität und
④ PCR-Zyklusbedingungen. Um die Gründe herauszufinden, sollten auch Analysen und Recherchen zu den oben genannten Links durchgeführt werden.
Vorlage:
① Die Vorlage enthält Verunreinigungsproteine
② Die Vorlage enthält Taq-Enzym-Inhibitoren
③ Die Proteine in der Vorlage werden nicht verdaut und entfernt, insbesondere die Histone in den Chromosomen
④ Bei der Extraktion und Vorbereitung des Templats ging zu viel verloren oder Phenol wurde eingeatmet
⑤Die Template-Nukleinsäure ist nicht vollständig denaturiert. Wenn die Qualität der Enzyme und Primer gut ist und keine Amplifikationsbanden auftreten, liegt höchstwahrscheinlich ein Fehler beim Verdauungsprozess der Probe oder beim Extraktionsprozess der Template-Nukleinsäure vor. Daher muss eine wirksame und stabile Verdauungslösung vorbereitet werden, und das Verfahren sollte festgelegt und nicht nach Belieben geändert werden. . Enzyminaktivierung: Es ist notwendig, das neue Enzym zu ersetzen oder sowohl alte als auch neue Enzyme gleichzeitig zu verwenden, um zu analysieren, ob falsch negative Ergebnisse durch Verlust oder unzureichende Enzymaktivität verursacht werden. Es sollte beachtet werden, dass manchmal das Taq-Enzym vergessen wird.Primer: Primerqualität, Primerkonzentration und ob die Konzentrationen der beiden Primer symmetrisch sind, sind häufige Gründe für PCR-Fehler oder unbefriedigende Amplifikationsbanden und leichte Diffusion. Bei einigen Chargen gibt es Probleme mit der Qualität der Primersynthese. Einer der beiden Primer hat eine hohe Konzentration und der andere eine niedrige Konzentration, was zu einer asymmetrischen Amplifikation mit geringer Effizienz führt.
Die Gegenmaßnahmen sind:
① Wählen Sie eine gute Primer-Syntheseeinheit.
② Bei der Konzentration der Primer sollte nicht nur der OD-Wert berücksichtigt werden, sondern auch die Primer-Stammlösung für die Agarosegelelektrophorese berücksichtigt werden. Es müssen Primerbänder vorhanden sein und die Helligkeit der beiden Primerbänder sollte ungefähr gleich sein. Beispielsweise hat ein Primer eine Bande und der andere Primer keine Bande. Bei Streifen kann die PCR zu diesem Zeitpunkt fehlschlagen und sollte durch Verhandlungen mit der Primersyntheseeinheit gelöst werden. Wenn ein Primer eine hohe Helligkeit und der andere eine niedrige Helligkeit aufweist, gleichen Sie die Konzentrationen beim Verdünnen der Primer aus.
③ Grundierungen sollten in hoher Konzentration und kleinen Mengen gelagert werden, um ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen oder eine langfristige Lagerung im Kühlschrank zu verhindern, was zu einer Verschlechterung und einem Abbau der Grundierungen führen kann.
④Das Primerdesign ist unangemessen, z. B. weil die Primerlänge nicht ausreicht, Dimere zwischen den Primern gebildet werden usw. Mg2+-Konzentration: Die Mg2+-Ionenkonzentration hat einen großen Einfluss auf die Effizienz der PCR-Amplifikation. Eine zu hohe Konzentration kann die Spezifität der PCR-Amplifikation verringern. Wenn die Konzentration zu niedrig ist, beeinträchtigt dies die PCR-Amplifikationsausbeute und führt sogar dazu, dass die PCR-Amplifikation ohne Amplifikationsbanden fehlschlägt. Änderungen im Reaktionsvolumen: Normalerweise betragen die für die PCR-Amplifikation verwendeten Volumina 20 µl, 30 µl und 50 µl. Oder 100 µl. Welches Volumen für die PCR-Amplifikation verwendet werden sollte, hängt von den verschiedenen Zwecken der wissenschaftlichen Forschung und klinischen Tests ab. Nachdem Sie ein kleines Volumen, z. B. 20 ul, und dann ein größeres Volumen hergestellt haben, müssen Sie die Bedingungen einhalten, da es sonst leicht zu Fehlschlägen kommt. Physikalische Gründe: Denaturierung ist für die PCR-Amplifikation sehr wichtig. Wenn die Denaturierungstemperatur niedrig und die Denaturierungszeit kurz ist, ist es sehr wahrscheinlich, dass falsch negative Ergebnisse auftreten; Die Glühtemperatur ist zu niedrig, was zu einer unspezifischen Amplifikation und einer Verringerung der spezifischen Amplifikationseffizienz führen kann. Die Glühtemperatur ist zu hoch. Beeinflusst stark die Bindung von Primern an Templates und verringert die Effizienz der PCR-Amplifikation. Manchmal ist es notwendig, ein Standardthermometer zu verwenden, um die Denaturierungs-, Annealing- und Extension-Temperaturen im Verstärker oder wasserlöslichen Gefäß zu überprüfen. Dies ist auch einer der Gründe für das Scheitern der PCR. Variation der Zielsequenz: Wenn die Zielsequenz mutiert oder gelöscht ist, was sich auf die spezifische Bindung des Primers an die Vorlage auswirkt, oder wenn Primer und Vorlage aufgrund der Löschung eines bestimmten Abschnitts der Zielsequenz die komplementäre Sequenz verlieren, erfolgt die PCR-Amplifikation wird keinen Erfolg haben.
2.falsch positiv Die angezeigte PCR-Amplifikationsbande stimmt mit der Zielsequenzbande überein, und manchmal ist die Bande geordneter und heller. Ungeeignetes Primerdesign: Die ausgewählte Amplifikationssequenz weist Homologie mit der Nicht-Ziel-Amplifikationssequenz auf, sodass es sich bei der PCR-Amplifikation beim amplifizierten PCR-Produkt um eine Nicht-Zielsequenz handelt. Wenn die Zielsequenz zu kurz ist oder der Primer zu kurz ist, kann es leicht zu falsch positiven Ergebnissen kommen. Grundierungen müssen neu gestaltet werden. Kreuzkontamination von Zielsequenzen oder Amplifikationsprodukten: Es gibt zwei Gründe für diese Kontamination: Erstens eine Kreuzkontamination des gesamten Genoms oder großer Fragmente, die zu falsch positiven Ergebnissen führt. Dieses falsch positive Ergebnis kann durch die folgenden Methoden behoben werden: Gehen Sie bei der Bedienung vorsichtig und vorsichtig vor, um zu verhindern, dass die Zielsequenz in die Probenpistole gesaugt wird oder aus dem Zentrifugenröhrchen spritzt. Mit Ausnahme von Enzymen und Substanzen, die hohen Temperaturen nicht standhalten, sollten alle Reagenzien oder Geräte mit hohem Druck sterilisiert werden. Alle Zentrifugenröhrchen und Probeninjektionspipettenspitzen sollten einmal verwendet werden. Bei Bedarf werden die Reaktionsgefäße und Reagenzien vor Zugabe der Probe mit ultraviolettem Licht bestrahlt, um die vorhandenen Nukleinsäuren zu zerstören. Der zweite Grund ist die Kontamination kleiner Nukleinsäurefragmente in der Luft. Diese kleinen Fragmente sind kürzer als die Zielsequenz, weisen aber eine gewisse Homologie auf. Sie können aneinander gespleißt werden, und nachdem sie zu den Primern komplementär sind, können die PCR-Produkte amplifiziert werden, was zu falsch positiven Ergebnissen führt, die durch verschachtelte PCR-Methoden reduziert oder eliminiert werden können.
3. Es treten unspezifische Amplifikationsbanden auf. Die Banden, die nach der PCR-Amplifikation erscheinen, stimmen nicht mit der erwarteten Größe überein, entweder größer oder kleiner, oder es treten sowohl spezifische Amplifikationsbanden als auch unspezifische Amplifikationsbanden gleichzeitig auf. Die Gründe für das Auftreten unspezifischer Banden sind: Erstens sind die Primer nicht vollständig komplementär zur Zielsequenz oder die Primer aggregieren unter Bildung von Dimeren. Der zweite Grund ist, dass die Mg2+-Ionenkonzentration zu hoch, die Annealing-Temperatur zu niedrig und die Anzahl der PCR-Zyklen zu hoch ist. Der zweite Faktor ist die Qualität und Quantität des Enzyms. Enzyme aus manchen Quellen neigen häufig zu unspezifischen Banden, Enzyme aus anderen Quellen jedoch nicht. Übermäßige Mengen an Enzymen können manchmal zu einer unspezifischen Verstärkung führen. Zu den Gegenmaßnahmen gehören: Grundierungen ggf. neu gestalten. Reduzieren Sie die Enzymmenge oder ersetzen Sie sie durch eine andere Quelle. Reduzieren Sie die Menge an Primern, erhöhen Sie entsprechend die Menge an Template und reduzieren Sie die Anzahl der Zyklen. Erhöhen Sie die Glühtemperatur entsprechend oder verwenden Sie die Zwei-Temperatur-Punktmethode (Denaturierung bei 93 °C, Glühen und Verlängerung bei etwa 65 °C).
4. Es treten schuppige Streifen oder Schlieren auf. Die PCR-Amplifikation erscheint manchmal als verschmierte Streifen, blattartige Streifen oder teppichartige Streifen. Die Gründe liegen oft in zu viel Enzym oder schlechter Enzymqualität, zu hoher dNTP-Konzentration, zu hoher Mg2+-Konzentration, zu niedriger Annealing-Temperatur und zu vielen Zyklen. Zu den Gegenmaßnahmen gehören: ① Reduzieren Sie die Enzymmenge oder ersetzen Sie das Enzym durch eine andere Quelle. ②Reduzieren Sie die Konzentration von dNTP. Reduzieren Sie die Mg2+-Konzentration entsprechend. Erhöhen Sie die Anzahl der Vorlagen und reduzieren Sie die Anzahl der Zyklen
