Separace a čištění proteinů je široce používáno v biochemickém výzkumu a aplikacích a je důležitou provozní dovedností. Typická eukaryotická buňka může obsahovat tisíce různých proteinů, některé jsou velmi bohaté a některé obsahují jen několik kopií. Aby bylo možné studovat určitéprotein, je nutné nejprve očistit protein od jiných proteinů a neproteinových molekul.

1. Metoda vysolováníprotein:

Neutrální sůl má významný vliv na rozpustnost bílkovin. Obecně platí, že se zvýšením koncentrace soli při nízké koncentraci soli se zvyšuje rozpustnost proteinu. Toto se nazývá solení; když se koncentrace soli dále zvyšuje, rozpustnost proteinu v různé míře klesá a odděluje se jeden po druhém. Tento jev se nazývá vysolování.

2. Metoda vrstvení izoelektrických bodů:

Elektrostatické odpuzování mezi částicemi je nejmenší, když je protein statický, takže rozpustnost je také nejmenší. Izoelektrické body různých proteinů jsou různé. pH kondicionačního roztoku lze použít k dosažení izoelektrického bodu proteinu, aby se akumuloval, ale tato metoda se zřídka používá samostatně a lze ji kombinovat s metodou vysolování.

3. Dialýza a ultrafiltrace:

Dialýza využívá semipermeabilní membránu k separaci proteinů různých molekulových velikostí. Ultrafiltrační metoda využívá vysoký tlak nebo odstředivou sílu k tomu, aby voda a další malé molekuly rozpuštěné látky prošly polopropustnou membránou, zatímcoproteinzůstává na membráně. Můžete si vybrat různé velikosti pórů pro zachycení proteinů různých molekulových hmotností.

4. Metoda gelové filtrace:

Také nazývaná vylučovací chromatografie nebo chromatografie na molekulovém sítu, je to jedna z nejužitečnějších metod pro separaci proteinových směsí podle velikosti molekul. Nejčastěji používanými výplňovými materiály v koloně jsou glukózový gel (Sephadex ged) a agarózový gel (agarózový gel).

5. Elektroforéza:

Za stejných podmínek pH lze oddělit různé proteiny v důsledku jejich různých molekulových hmotností a různého náboje v elektrickém poli. Za pozornost stojí izoelektrická setová elektroforéza, která využívá jako nosič amfolyt. Během elektroforézy tvoří amfolyt gradient pH, který se postupně přidává od kladné elektrody k záporné elektrodě. Když v něm protein s určitým nábojem plave, dostane se k sobě. Hodnota pH elektrického bodu je nespojitá a tuto metodu lze použít k analýze a přípravě různých proteinů.

6. Iontová komunikační chromatografie:

iontová komunikační činidla zahrnují kationtová komunikační činidla (jako je karboxymethylcelulóza; CM-celulóza) a aniontová komunikační činidla (diethylaminoethylcelulóza). Při průchodu iontovou komunikační chromatografickou kolonou je protein s opačným nábojem než má iontový komunikační prostředek adsorbován na iontovém komunikačním činidle a poté adsorbovánproteinse eluuje změnou pH nebo iontové síly.

7. Afinitní chromatografie:

Afinitní chromatografie je extrémně užitečná metoda pro separaci proteinů. Často vyžaduje pouze jeden krok k oddělení určitého proteinu, který má být purifikován, od neuspořádané proteinové směsi s vysokou čistotou.

Tato metoda je založena spíše na specifické než kovalentní vazbě určitých proteinů na jinou molekulu nazývanou ligand (Ligand).

Základní princip:

proteiny existují v neuspořádané směsi v tkáních nebo buňkách a každý typ buňky obsahuje tisíce různých proteinů. Proto je rozlišení mezi proteiny důležitou součástí biochemie a nebylo to jediné. Nebo sada hotových metod může odstranit jakýkoli druh proteinu z neuspořádaného smíšeného proteinu, takže se často používá několik metod v kombinaci.