FAQ PCR 1. Falsu negativu, ùn appare micca una banda di amplificazione 2. Falsi pusitivi 3. Appariscenu bande di amplificazione non specifiche 4. Appariscenu strisce di trascinamentu squamose o strisce smear：
1 Falsu negativu, nisuna banda amplificata appare L'aspetti chjave di a reazione PCR sò
① preparazione di l'acidu nucleicu mudellu
② prima qualità è specificità
③ qualità enzyme è
④ Cundizioni di u ciclu PCR. Per truvà i motivi, l'analisi è a ricerca anu da esse realizatu ancu nantu à i ligami sopra.
Template:
① U mudellu cuntene proteine impurità
② U mudellu cuntene inhibitori di l'enzima Taq
③ I proteini in u mudellu ùn sò micca digeriti è eliminati, in particulare l'histoni in i cromusomi
④ Troppu hè statu persu durante l'estrazione è a preparazione di u mudellu, o fenol hè statu inalatu
⑤L'acidu nucleicu mudellu ùn hè micca completamente denaturatu. Quandu a qualità di l'enzimi è i primeri hè bona, se i bandi di amplificazione ùn si prisentanu micca, hè più prubabile chì ci hè qualcosa di sbagliatu cù u prucessu di digestioni di u specimenu o u prucessu di estrazione di l'acidu nucleicu di mudellu. Dunque, una suluzione di digestioni efficace è stabile deve esse preparata, è a prucedura deve esse fissata è ùn deve esse cambiata à vuluntà. . Inattivazione di l'enzima: Hè necessariu di rimpiazzà a nova enzima, o aduprà enzimi vechji è novi à u stessu tempu per analizà se falsi negativi sò causati da perdita o attività enzyme insufficiente. Hè devi esse nutatu chì qualchì volta l'enzyme Taq hè sminticatu.Primers: Primu qualità, cuncintrazione primer, è s'ellu i cuncintrazioni di i dui primers sò simmetrici sò ragiuni cumuni per fallimentu PCR o bande di amplificazione insatisfactory è diffusione faciule. Ci sò prublemi cù a qualità di sintesi di prima in certi batch. Unu di i dui primers hà una cuncentrazione alta è l'altru hà una cuncentrazione bassa, risultatu in una amplificazione asimmetrica di bassa efficienza.
E contramisure sò:
① Sceglite una bona unità di sintesi di primer.
② A cuncentrazione di primers ùn deve micca solu guardà u valore OD, ma ancu attentu à a suluzione di prima per l'elettroforesi di gel d'agarose. Ci deve esse bande di prima, è a luminosità di e duie bande di prima deve esse quasi u listessu. Per esempiu, un primer hà una banda è l'altru prima ùn hà micca banda. Per i strisce, a PCR pò fallu à questu tempu è deve esse risolta attraversu a negoziazione cù l'unità di sintesi di primer. Se un primer hà una luminosità alta è l'altru hà una luminosità bassa, equilibrà e cuncentrazioni quandu dilute i primers.
③ Primers deve esse guardatu in alta cuncentrazione è picculi quantità per prevene a congelazione ripetuta è u scongelu o u almacenamentu à longu andà in u frigorifero, chì pò purtà à u deterioramentu è a degradazione di i primers.
④U primu disegnu ùn hè micca ragiunate, cum'è a lunghezza di prima ùn hè micca abbastanza, i dimeri sò furmati trà i primi, etc. Cuncentrazione di Mg2 +: a concentrazione di ioni Mg2 + hà una grande influenza in l'efficienza di amplificazione PCR. Se a cuncentrazione hè troppu alta, pò riduce a specificità di l'amplificazione PCR. Se a cuncentrazione hè troppu bassu, affetterà u rendiment di l'amplificazione di PCR è ancu pruvucarà l'amplificazione di PCR per fallu senza amplificazione di bande. Cambiamenti in u voluminu di reazione: Di solitu i volumi utilizati per l'amplificazione di PCR sò 20ul, 30ul, è 50ul. O 100ul, chì volume deve esse usatu per l'amplificazione di PCR hè stabilitu secondu diversi scopi di ricerca scientifica è teste cliniche. Dopu avè fattu un picculu voluminu, cum'è 20ul, è dopu fà un voluminu più grande, duvete seguità e cundizioni, altri ùn facia micca facilmente. Motivi fisichi: A denaturazione hè assai impurtante per l'amplificazione PCR. Se a temperatura di denaturazione hè bassa è u tempu di denaturazione hè cortu, i falsi negativi sò assai prubabile di accade; a temperatura di annealing hè troppu bassu, chì pò causà amplificazione non specifica è riduce l'efficienza di amplificazione specifica. A temperatura di annealing hè troppu altu. Affetta assai a legame di primers à i mudelli è riduce l'efficienza di amplificazione PCR. A volte, hè necessariu di utilizà un termometru standard per verificà a temperatura di denaturazione, annealing è estensione in l'amplificatore o pota soluble in acqua. Questu hè ancu unu di i mutivi di fallimentu PCR. Variazione di a sequenza di destinazione: Se a sequenza di destinazione hè mutata o sguassata, chì affetta u ligame specificu di l'amorce à u mudellu, o l'amori è u mudellu perdenu a sequenza cumplementaria per via di l'eliminazione di un certu segmentu di a sequenza di destinazione, l'amplificazione PCR. ùn sarà micca successu.
2.false pusitivu A banda di amplificazione PCR chì appare hè coherente cù a banda di sequenza di destinazione, è qualchì volta a banda hè più ordinata è più luminosa. Disegnu di primer inappropriatu: A sequenza di amplificazione selezziunata hà l'omologia cù a sequenza di amplificazione non-target, cusì quandu si esegue l'amplificazione PCR, u pruduttu PCR amplificatu hè una sequenza non-target. Se a sequenza di destinazione hè troppu corta o u primer hè troppu cortu, falsi pusitivi ponu esse facilmente. I primi deve esse riprogettati. Cuntaminazione incruciata di sequenze di destinazione o prudutti di amplificazione: Ci hè dui motivi per questa contaminazione: Prima, a contaminazione incruciata di u genoma sanu o di frammenti grossi, chì porta à falsi pusitivi. Stu falsu pusitivu pò esse risoltu da i seguenti metudi: Attentu è gentile quandu operate per impedisce chì a sequenza di destinazione sia aspirata in a pistola di mostra o spruzzata da u tubu di centrifuga. Eccettu per l'enzimi è i sustanzi chì ùn ponu micca resistenti à e alte temperature, tutti i reagenti o l'equipaggiu deve esse sterilizzati da alta pressione. Tutti i tubi di centrifuga è i puntali di pipette di iniezione di campionu deve esse usatu una volta. In casu di necessariu, i tubi di reazzione è i reagenti sò irradiati cù luce ultravioletta prima di aghjunghje u specimenu per distrughje l'acidi nucleici prisenti. U sicondu hè a contaminazione di picculi frammenti di l'acidi nucleici in l'aria. Questi picculi frammenti sò più brevi di a sequenza di destinazione, ma anu una certa omologia. Puderanu esse spliced à l'altri, è dopu esse cumplementarii à i primi, i prudutti di a PCR ponu esse amplificati, risultatu in falsi pusitivi, chì ponu esse ridotti o eliminati da i metudi di PCR nidificati.
3.Bandi d'amplificazione non-specifici appariscenu I bandi chì appariscenu dopu à l'amplificazione di PCR sò inconsistenti cù a dimensione prevista, o più grande o più chjuca, o i dui bandi di amplificazione specifichi è i bandi di amplificazione non-specifici appariscenu à u stessu tempu. I ragiuni per l'apparizione di bande non specifiche sò: prima, i primers ùn sò micca cumpletamente cumplementarii à a sequenza di destinazione, o i primers aggregate per furmà dimeri. U sicondu mutivu hè chì a cuncentrazione di ioni Mg2 + hè troppu altu, a temperatura di annealing hè troppu bassu, è u nùmeru di cicli di PCR hè troppu altu. U sicondu fattore hè a qualità è a quantità di l'enzima. L'enzimi da alcune fonti sò spessu propensi à bande non specifiche, ma l'enzimi da altre fonti ùn sò micca. Una quantità eccessiva di enzimi pò purtà à l'amplificazione non specifica. E contramisure includenu: ridisegnu primers se ne necessariu. Reduce a quantità di enzima o rimpiazzà cù una altra fonte. Reduce a quantità di primers, cresce a quantità di mudellu in modu adattatu, è riduce u nùmeru di ciculi. Aumenter la température de recuit de manière appropriée ou utiliser le procédé à deux points de température (dénaturation à 93°C, recuit et extension autour de 65°C).
4.Flaky drag o smears apparisce L'amplificazione di PCR a volte appare cum'è bande smeared, bande di foglia o bande di tappe. I ragiuni sò spessu causati da troppu enzyme o mala qualità di enzyme, troppu altu cuncintrazzioni dNTP, troppu altu cuncintrazzioni Mg2 +, troppu bassu annealing temperature, è troppu ciculi. E contramisure includenu: ① Reduce a quantità di enzima, o rimpiazzà l'enzima cù una altra fonte. ②Reduce a cuncentrazione di dNTP. Riduce in modu adattatu a cuncentrazione di Mg2+. Aumentà a quantità di mudelli è riduce u numeru di ciculi
