Nukleinska kiselina se dijeli na deoksiribonukleinsku kiselinu (DNK) i ribonukleinsku kiselinu (RNA), među kojima se RNK može podijeliti na ribosomalnu RNK (rRNA), glasničku RNK (mRNA) i prijenosnu RNK (tRNA) prema različitim funkcijama.

DNK je uglavnom koncentrisana u jezgru, mitohondrijima i hloroplastima, dok je RNK uglavnom raspoređena u citoplazmi.

Budući da purinske baze i pirimidinske baze imaju konjugirane dvostruke veze u nukleinskim kiselinama, nukleinske kiseline imaju karakteristike ultraljubičaste apsorpcije. Ultraljubičasta apsorpcija DNK natrijumovih soli je oko 260nm, a njena apsorpcija je izražena kao A260, a nalazi se na dnu apsorpcije na 230nm, tako da se može koristiti ultraljubičasta spektroskopija. Nukleinske kiseline se kvantitativno i kvalitativno određuju luminometrom.

Nukleinske kiseline su amfoliti, koji su ekvivalentni polikiselinama. Nukleinske kiseline mogu se disocirati u anione korištenjem neutralnih ili alkalnih pufera i staviti u električno polje da se kreću prema anodi. Ovo je princip elektroforeze.

Principi i zahtjevi ekstrakcije i prečišćavanja nukleinske kiseline

1. Osigurati integritet primarne strukture nukleinske kiseline

2. Uklonite kontaminaciju drugih molekula (kao što je isključivanje RNA interferencije prilikom ekstrakcije DNK)

3. U uzorcima nukleinske kiseline ne bi trebalo biti organskih rastvarača i visokih koncentracija metalnih jona koji inhibiraju enzime

4. Smanjite makromolekularne supstance kao što su proteini, polisaharidi i lipidi što je više moguće

Metoda ekstrakcije i prečišćavanja nukleinske kiseline

1. Metoda ekstrakcije fenolom/hloroformom

Izumljen je 1956. Nakon tretiranja slomljene ćelijske tečnosti ili homogenata tkiva fenolom/hloroformom, komponente nukleinske kiseline, uglavnom DNK, se rastvaraju u vodenoj fazi, lipidi su uglavnom u organskoj fazi, a proteini se nalaze između dva faze.

2. Alkoholna precipitacija

Etanol može eliminirati hidratacijski sloj nukleinske kiseline i izložiti negativno nabijenu fosfatnu grupu, a pozitivno nabijeni ioni kao što je NA﹢ mogu se kombinirati sa fosfatnom grupom kako bi formirali precipitat.

3. Metoda hromatografske kolone

Preko specijalnog adsorpcionog materijala na bazi silicijum-dioksida, DNK se može specifično adsorbovati, dok RNK i protein mogu da prođu glatko, a zatim koriste visoku so i nizak pH da vežu nukleinsku kiselinu i eluiraju sa niskom solju i visokim pH da odvoje i pročiste nukleinsku kiselinu. kiselina.

4. Alkalna metoda termičkog krekiranja

Alkalna ekstrakcija uglavnom koristi topološke razlike između kovalentno zatvorenih kružnih plazmida i linearnog hromatina za njihovo razdvajanje. U alkalnim uslovima, denaturirani proteini su rastvorljivi.

5. Metoda pirolize ključanja

Otopina DNK se termički obrađuje kako bi se iskoristila svojstva linearnih molekula DNK za odvajanje fragmenata DNK od taloga formiranog od denaturiranih proteina i ćelijskih ostataka centrifugiranjem.

6. Metoda nanomagnetnih kuglica

Koristeći nanotehnologiju za poboljšanje i modifikaciju površine superparamagnetnih nanočestica, pripremaju se nanomagnetne perle superparamagnetnog silicijum oksida. Magnetne kuglice mogu specifično prepoznati i efikasno se vezati za molekule nukleinske kiseline na mikroskopskom interfejsu. Koristeći superparamagnetna svojstva silicijumskih nanosfera, pod dejstvom haotropnih soli (gvanidin hidrohlorid, gvanidin izotiocijanat, itd.) i spoljašnjeg magnetnog polja, izolovani su DNK i RNK iz krvi, životinjskog tkiva, hrane, patogenih mikroorganizama i drugih uzoraka.