PCR FAQ 1. Lažno negativan, ne pojavljuje se pojas za pojačavanje 2. Lažno pozitivan 3. Pojavljuju se nespecifične trake za pojačavanje 4. Pojavljuju se ljuskave trake za povlačenje ili razmazivanje:

1Lažno negativan, ne pojavljuje se pojačana traka Ključni aspekti PCR reakcije su

① priprema šablonske nukleinske kiseline

② kvaliteta i specifičnost prajmera

③ kvaliteta enzima i

④ Uslovi PCR ciklusa. Da biste pronašli razloge, potrebno je izvršiti analizu i istraživanje na gornjim linkovima.

Šablon:

① Šablon sadrži proteine ​​nečistoće

② Šablon sadrži inhibitore enzima Taq

③ Proteini u šablonu se ne probavljaju i ne uklanjaju, posebno histoni u hromozomima

④ Previše je izgubljeno tokom ekstrakcije i pripreme šablona ili je fenol udahnut

⑤Nukleinska kiselina šablona nije potpuno denaturirana. Kada je kvalitet enzima i prajmera dobar, ako se ne pojave trake za amplifikaciju, najvjerovatnije je da nešto nije u redu s procesom digestije uzorka ili procesom ekstrakcije šablonske nukleinske kiseline. Stoga se mora pripremiti efikasan i stabilan rastvor za varenje, a postupak treba popraviti i ne treba ga mijenjati po volji. . Inaktivacija enzima: Neophodno je zamijeniti novi enzim, ili istovremeno koristiti i stare i nove enzime kako bi se analiziralo jesu li lažno negativni uzrokovani gubitkom ili nedovoljnom aktivnošću enzima. Treba napomenuti da se ponekad zaboravlja Taq enzim. Prajmeri: Kvalitet prajmera, koncentracija prajmera i da li su koncentracije dva prajmera simetrične su uobičajeni razlozi za neuspeh PCR-a ili nezadovoljavajuće trake amplifikacije i laku difuziju. U nekim serijama postoje problemi s kvalitetom sinteze prajmera. Jedan od dva prajmera ima visoku koncentraciju, a drugi nisku koncentraciju, što rezultira niskoefikasnom asimetričnom amplifikacijom.

Protivmjere su:

① Odaberite dobru jedinicu za sintezu prajmera.

② Koncentracija prajmera ne treba da gleda samo na vrednost OD, već i na osnovni rastvor prajmera za elektroforezu u agaroznom gelu. Moraju postojati prajmer trake, a svjetlina dviju prajmer traka bi trebala biti otprilike ista. Na primjer, jedan prajmer ima traku, a drugi prajmer nema traku. Za trake, PCR u ovom trenutku možda neće uspjeti i treba ga riješiti pregovorima s jedinicom za sintezu prajmera. Ako jedan prajmer ima veliku svjetlinu, a drugi nisku svjetlinu, uravnotežite koncentracije prilikom razrjeđivanja prajmera.

③ Prajmere treba čuvati u visokoj koncentraciji i malim količinama kako bi se spriječilo ponovno zamrzavanje i odmrzavanje ili dugotrajno skladištenje u frižideru, što može dovesti do propadanja i degradacije prajmera.

④Dizajn prajmera je nerazuman, kao što je dužina prajmera nije dovoljna, dimeri se formiraju između prajmera, itd. Koncentracija Mg2+: Koncentracija jona Mg2+ ima veliki uticaj na efikasnost PCR amplifikacije. Ako je koncentracija previsoka, može smanjiti specifičnost PCR amplifikacije. Ako je koncentracija preniska, to će utjecati na prinos PCR amplifikacije, pa čak i uzrokovati neuspjeh PCR amplifikacije bez pojačanja traka. Promene u zapremini reakcije: Obično su zapremine koje se koriste za PCR amplifikaciju 20ul, 30ul i 50ul. Ili 100ul, kolika zapremina treba da se koristi za PCR amplifikaciju određuje se u skladu sa različitim svrhama naučnog istraživanja i kliničkog testiranja. Nakon što napravite malu zapreminu, kao što je 20ul, a zatim napravite veću zapreminu, morate pratiti uslove, inače će lako propasti. Fizički razlozi: Denaturacija je veoma važna za PCR amplifikaciju. Ako je temperatura denaturacije niska, a vrijeme denaturacije kratko, vrlo je vjerojatno da će doći do lažnih negativnih rezultata; temperatura žarenja je preniska, što može uzrokovati nespecifično pojačanje i smanjiti efikasnost specifičnog pojačanja. Temperatura žarenja je previsoka. Jako utiče na vezivanje prajmera za šablone i smanjuje efikasnost PCR amplifikacije. Ponekad je potrebno koristiti standardni termometar za provjeru temperature denaturacije, žarenja i proširenja u pojačalu ili loncu rastvorljivom u vodi. Ovo je također jedan od razloga neuspjeha PCR-a. Varijacija ciljne sekvence: Ako je ciljna sekvenca mutirana ili izbrisana, što utiče na specifično vezivanje prajmera za šablon, ili prajmer i šablon gube komplementarnu sekvencu zbog brisanja određenog segmenta ciljne sekvence, PCR amplifikacija neće biti uspješan.

2. lažno pozitivna PCR amplifikacijska traka koja se pojavljuje je u skladu sa trakom ciljne sekvence, a ponekad je traka urednija i svjetlija. Neodgovarajući dizajn prajmera: Odabrana sekvenca amplifikacije ima homologiju sa sekvencom koja nije ciljna amplifikacija, tako da kada se izvodi PCR amplifikacija, amplificirani PCR proizvod je neciljana sekvenca. Ako je ciljna sekvenca prekratka ili prajmer prekratak, lako se mogu pojaviti lažno pozitivni rezultati. Prajmere je potrebno redizajnirati. Unakrsna kontaminacija ciljnih sekvenci ili produkata amplifikacije: Dva su razloga za ovu kontaminaciju: Prvo, unakrsna kontaminacija cijelog genoma ili velikih fragmenata, što dovodi do lažnih pozitivnih rezultata. Ovaj lažno pozitivan može se riješiti sljedećim metodama: Budite pažljivi i nježni kada radite kako biste spriječili da se ciljna sekvenca uvuče u pištolj za uzorke ili da ispljune iz epruvete za centrifugu. Osim enzima i tvari koje ne podnose visoke temperature, svi reagensi ili oprema trebaju biti sterilizirani visokim pritiskom. Sve epruvete za centrifugiranje i vrhove pipete za ubrizgavanje uzorka treba koristiti jednom. Ako je potrebno, reakcijske epruvete i reagensi se zrače ultraljubičastim svjetlom prije dodavanja uzorka kako bi se uništile prisutne nukleinske kiseline. Drugi je kontaminacija malih fragmenata nukleinskih kiselina u zraku. Ovi mali fragmenti su kraći od ciljne sekvence, ali imaju određenu homologiju. Mogu se spojiti jedni s drugima, a nakon što budu komplementarni prajmerima, PCR proizvodi se mogu pojačati, što rezultira lažno pozitivnim rezultatima, koji se mogu smanjiti ili eliminirati ugniježđenim PCR metodama.

 

3. Pojavljuju se nespecifične amplifikacijske trake Trake koje se pojavljuju nakon PCR amplifikacije nisu u skladu s očekivanom veličinom, bilo veće ili manje, ili se istovremeno pojavljuju i trake specifične amplifikacije i nespecifične amplifikacijske trake. Razlozi za pojavu nespecifičnih traka su: prvo, prajmeri nisu u potpunosti komplementarni ciljnoj sekvenci, ili se prajmeri agregiraju i formiraju dimere. Drugi razlog je da je koncentracija Mg2+ jona previsoka, temperatura žarenja preniska, a broj PCR ciklusa previsok. Drugi faktor je kvaliteta i količina enzima. Enzimi iz nekih izvora često su skloni nespecifičnim trakama, ali enzimi iz drugih izvora ne. Prekomjerne količine enzima ponekad mogu dovesti do nespecifične amplifikacije. Protivmjere uključuju: redizajn prajmera ako je potrebno. Smanjite količinu enzima ili ga zamijenite drugim izvorom. Smanjite količinu prajmera, povećajte količinu šablona na odgovarajući način i smanjite broj ciklusa. Povećajte temperaturu žarenja na odgovarajući način ili koristite metodu dvije temperature (denaturacija na 93°C, žarenje i proširenje oko 65°C).

 

4. Pojavljuju se ljuspice ili mrlje. PCR amplifikacija se ponekad pojavljuje kao razmazane trake, trake nalik na listove ili trake nalik na tepih. Razlozi su često uzrokovani previše enzima ili lošim kvalitetom enzima, previsoka koncentracija dNTP, previsoka koncentracija Mg2+, preniska temperatura žarenja i previše ciklusa. Protumjere uključuju: ① Smanjite količinu enzima ili zamijenite enzim drugim izvorom. ②Smanjite koncentraciju dNTP. Prikladno smanjite koncentraciju Mg2+. Povećajte količinu šablona i smanjite broj ciklusa