পিসিআর FAQ 1. মিথ্যা নেতিবাচক, কোন পরিবর্ধন ব্যান্ড প্রদর্শিত হয় না 2. মিথ্যা পজিটিভ 3. অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন ব্যান্ড প্রদর্শিত হয় 4. ফ্ল্যাকি ড্র্যাগ স্ট্রিপ বা স্মিয়ার স্ট্রিপ প্রদর্শিত হয়：

1মিথ্যা নেতিবাচক, কোন পরিবর্ধিত ব্যান্ড প্রদর্শিত হয় না পিসিআর প্রতিক্রিয়ার মূল দিকগুলি

① টেমপ্লেট নিউক্লিক অ্যাসিডের প্রস্তুতি

② প্রাইমার গুণমান এবং নির্দিষ্টতা

③ এনজাইম গুণমান এবং

④ পিসিআর চক্রের শর্ত। কারণ অনুসন্ধানের জন্য উপরের লিঙ্কগুলিতেও বিশ্লেষণ এবং গবেষণা করা উচিত।

টেমপ্লেট:

① টেমপ্লেটে অপরিষ্কার প্রোটিন রয়েছে

② টেমপ্লেটটিতে Taq এনজাইম ইনহিবিটর রয়েছে

③ টেমপ্লেটের প্রোটিনগুলি হজম হয় না এবং সরানো হয় না, বিশেষ করে ক্রোমোজোমের হিস্টোনগুলি

④ টেমপ্লেট নিষ্কাশন এবং প্রস্তুত করার সময় খুব বেশি হারিয়ে গেছে, বা ফেনল শ্বাস নেওয়া হয়েছিল

⑤ টেমপ্লেট নিউক্লিক অ্যাসিড সম্পূর্ণরূপে বিকৃত নয়। যখন এনজাইম এবং প্রাইমারগুলির গুণমান ভাল হয়, যদি পরিবর্ধন ব্যান্ডগুলি উপস্থিত না হয়, সম্ভবত নমুনার হজম প্রক্রিয়া বা টেমপ্লেট নিউক্লিক অ্যাসিড নিষ্কাশন প্রক্রিয়ার সাথে কিছু ভুল আছে। অতএব, একটি কার্যকর এবং স্থিতিশীল হজম সমাধান প্রস্তুত করা আবশ্যক, এবং পদ্ধতিটি স্থির করা উচিত এবং ইচ্ছামত পরিবর্তন করা উচিত নয়। . এনজাইম নিষ্ক্রিয়করণ: মিথ্যা নেতিবাচক ক্ষতি বা অপর্যাপ্ত এনজাইম কার্যকলাপের কারণে হয় কিনা তা বিশ্লেষণ করতে নতুন এনজাইম প্রতিস্থাপন করা বা একই সময়ে পুরানো এবং নতুন উভয় এনজাইম ব্যবহার করা প্রয়োজন। এটা লক্ষ করা উচিত যে কখনও কখনও Taq এনজাইম ভুলে যায়৷ প্রাইমার: প্রাইমারের গুণমান, প্রাইমারের ঘনত্ব এবং দুটি প্রাইমারের ঘনত্ব প্রতিসাম্য কিনা তা PCR ব্যর্থতা বা অসন্তোষজনক পরিবর্ধন ব্যান্ড এবং সহজ প্রসারণের সাধারণ কারণ৷ কিছু ব্যাচে প্রাইমার সংশ্লেষণের মান নিয়ে সমস্যা রয়েছে। দুটি প্রাইমারের একটিতে উচ্চ ঘনত্ব রয়েছে এবং অন্যটিতে কম ঘনত্ব রয়েছে, যার ফলে কম-দক্ষতা অসমমিতিক পরিবর্ধন।

প্রতিরোধ ব্যবস্থা হল:

① একটি ভাল প্রাইমার সংশ্লেষণ ইউনিট নির্বাচন করুন।

② প্রাইমারগুলির ঘনত্ব শুধুমাত্র OD মানকে দেখতে হবে না, তবে অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরসিসের জন্য প্রাইমার স্টক সমাধানের দিকেও মনোযোগ দিতে হবে। প্রাইমার ব্যান্ড থাকতে হবে এবং দুটি প্রাইমার ব্যান্ডের উজ্জ্বলতা মোটামুটি একই হওয়া উচিত। উদাহরণস্বরূপ, একটি প্রাইমারের একটি ব্যান্ড আছে এবং অন্য প্রাইমারে কোন ব্যান্ড নেই। স্ট্রিপগুলির জন্য, PCR এই সময়ে ব্যর্থ হতে পারে এবং প্রাইমার সংশ্লেষণ ইউনিটের সাথে আলোচনার মাধ্যমে সমাধান করা উচিত। যদি একটি প্রাইমারের উজ্জ্বলতা বেশি থাকে এবং অন্যটির উজ্জ্বলতা কম থাকে, তাহলে প্রাইমারগুলি পাতলা করার সময় ঘনত্বের ভারসাম্য বজায় রাখুন।

③ প্রাইমারগুলিকে উচ্চ ঘনত্ব এবং অল্প পরিমাণে সংরক্ষণ করা উচিত যাতে বারবার জমাট বাঁধা এবং গলানো বা ফ্রিজে দীর্ঘমেয়াদী স্টোরেজ রোধ করা যায়, যা প্রাইমারগুলির অবনতি এবং ক্ষয় হতে পারে।

④প্রাইমার ডিজাইন অযৌক্তিক, যেমন প্রাইমারের দৈর্ঘ্য যথেষ্ট নয়, প্রাইমারের মধ্যে ডাইমার তৈরি হয়, ইত্যাদি। ঘনত্ব খুব বেশি হলে, এটি পিসিআর পরিবর্ধনের নির্দিষ্টতা কমাতে পারে। যদি ঘনত্ব খুব কম হয়, তবে এটি পিসিআর পরিবর্ধনের ফলনকে প্রভাবিত করবে এবং এমনকি ব্যান্ডগুলিকে পরিবর্ধন না করেও পিসিআর পরিবর্ধন ব্যর্থ হবে। প্রতিক্রিয়া আয়তনের পরিবর্তন: সাধারণত PCR পরিবর্ধনের জন্য ব্যবহৃত ভলিউমগুলি হল 20ul, 30ul এবং 50ul। অথবা 100ul, পিসিআর পরিবর্ধনের জন্য কী পরিমাণ ব্যবহার করা উচিত তা বৈজ্ঞানিক গবেষণা এবং ক্লিনিকাল পরীক্ষার বিভিন্ন উদ্দেশ্য অনুসারে সেট করা হয়েছে। একটি ছোট ভলিউম তৈরি করার পরে, যেমন 20ul, এবং তারপরে একটি বড় ভলিউম তৈরি করার পরে, আপনাকে অবশ্যই শর্তগুলি অনুসরণ করতে হবে, অন্যথায় এটি সহজেই ব্যর্থ হবে৷ শারীরিক কারণ: পিসিআর পরিবর্ধনের জন্য ডিনাচুরেশন খুবই গুরুত্বপূর্ণ। যদি বিকৃতকরণের তাপমাত্রা কম হয় এবং বিকৃতকরণের সময় কম হয়, তাহলে মিথ্যা নেতিবাচক ঘটতে পারে; অ্যানিলিং তাপমাত্রা খুব কম, যা অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনের কারণ হতে পারে এবং নির্দিষ্ট পরিবর্ধন দক্ষতা হ্রাস করতে পারে। অ্যানিলিং তাপমাত্রা খুব বেশি। টেমপ্লেটগুলিতে প্রাইমারের বাঁধনকে অত্যন্ত প্রভাবিত করে এবং পিসিআর পরিবর্ধন দক্ষতা হ্রাস করে। কখনও কখনও অ্যামপ্লিফায়ার বা জল-দ্রবণীয় পাত্রে বিকৃতকরণ, অ্যানিলিং এবং এক্সটেনশন তাপমাত্রা পরীক্ষা করার জন্য একটি আদর্শ থার্মোমিটার ব্যবহার করা প্রয়োজন। এটিও পিসিআর ব্যর্থতার অন্যতম কারণ। টার্গেট সিকোয়েন্স ভ্যারিয়েশন: যদি টার্গেট সিকোয়েন্স মিউটেট করা হয় বা মুছে ফেলা হয়, যা টেমপ্লেটের সাথে প্রাইমারের নির্দিষ্ট বাঁধনকে প্রভাবিত করে, অথবা প্রাইমার এবং টেমপ্লেট টার্গেট সিকোয়েন্সের একটি নির্দিষ্ট সেগমেন্ট মুছে ফেলার কারণে পরিপূরক ক্রম হারায়, PCR পরিবর্ধন সফল হবে না।

2. মিথ্যা পজিটিভ PCR পরিবর্ধন ব্যান্ড যেটি প্রদর্শিত হয় তা লক্ষ্য ক্রম ব্যান্ডের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, এবং কখনও কখনও ব্যান্ডটি আরও সুশৃঙ্খল এবং উজ্জ্বল হয়। অনুপযুক্ত প্রাইমার ডিজাইন: নির্বাচিত পরিবর্ধন অনুক্রমের অ-লক্ষ্য পরিবর্ধন ক্রম সহ সমতা রয়েছে, তাই পিসিআর পরিবর্ধন সম্পাদন করার সময়, পরিবর্ধিত পিসিআর পণ্যটি একটি অ-লক্ষ্য ক্রম। লক্ষ্য ক্রম খুব ছোট বা প্রাইমার খুব ছোট হলে, মিথ্যা ইতিবাচক সহজেই ঘটতে পারে। প্রাইমার পুনরায় ডিজাইন করা প্রয়োজন। লক্ষ্য ক্রম বা পরিবর্ধন পণ্যগুলির ক্রস-দূষণ: এই দূষণের দুটি কারণ রয়েছে: প্রথমত, পুরো জিনোম বা বড় টুকরোগুলির ক্রস-দূষণ, যা মিথ্যা পজিটিভের দিকে পরিচালিত করে। এই মিথ্যা পজিটিভটি নিম্নলিখিত পদ্ধতিগুলির দ্বারা সমাধান করা যেতে পারে: লক্ষ্য ক্রমটি নমুনা বন্দুকের মধ্যে চুষে যাওয়া বা সেন্ট্রিফিউজ টিউব থেকে স্প্ল্যাশ করা থেকে প্রতিরোধ করার জন্য পরিচালনা করার সময় সতর্কতা অবলম্বন করুন। উচ্চ তাপমাত্রা সহ্য করতে পারে না এমন এনজাইম এবং পদার্থ ব্যতীত, সমস্ত বিকারক বা সরঞ্জাম উচ্চ চাপ দ্বারা জীবাণুমুক্ত করা উচিত। সমস্ত সেন্ট্রিফিউজ টিউব এবং নমুনা ইনজেকশন পাইপেট টিপস একবার ব্যবহার করা উচিত। প্রয়োজন হলে, উপস্থিত নিউক্লিক অ্যাসিড ধ্বংস করার জন্য নমুনা যোগ করার আগে প্রতিক্রিয়া টিউব এবং বিকারকগুলি অতিবেগুনী আলো দিয়ে বিকিরণ করা হয়। দ্বিতীয়টি হল বাতাসে নিউক্লিক অ্যাসিডের ছোট ছোট টুকরোগুলির দূষণ। এই ছোট খণ্ডগুলো লক্ষ্য ক্রম থেকে ছোট, কিন্তু নির্দিষ্ট সমতা আছে। এগুলি একে অপরের সাথে বিভক্ত করা যেতে পারে এবং প্রাইমারগুলির পরিপূরক হওয়ার পরে, পিসিআর পণ্যগুলিকে প্রশস্ত করা যেতে পারে, ফলস্বরূপ মিথ্যা পজিটিভ, যা নেস্টেড পিসিআর পদ্ধতি দ্বারা হ্রাস বা নির্মূল করা যেতে পারে।

 

3. অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন ব্যান্ডগুলি প্রদর্শিত হয় PCR পরিবর্ধনের পরে যে ব্যান্ডগুলি প্রদর্শিত হয় সেগুলি প্রত্যাশিত আকারের সাথে অসামঞ্জস্যপূর্ণ, হয় বড় বা ছোট, অথবা উভয় নির্দিষ্ট পরিবর্ধন ব্যান্ড এবং অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধন ব্যান্ড একই সময়ে উপস্থিত হয়৷ অ-নির্দিষ্ট ব্যান্ডগুলির উপস্থিতির কারণগুলি হল: প্রথমত, প্রাইমারগুলি লক্ষ্য অনুক্রমের সম্পূর্ণ পরিপূরক নয়, বা প্রাইমারগুলি ডাইমার গঠনের জন্য একত্রিত হয়। দ্বিতীয় কারণ হল যে Mg2+ আয়ন ঘনত্ব খুব বেশি, অ্যানিলিং তাপমাত্রা খুব কম, এবং PCR চক্রের সংখ্যা খুব বেশি। দ্বিতীয় ফ্যাক্টর হল এনজাইমের গুণমান এবং পরিমাণ। কিছু উত্স থেকে এনজাইমগুলি প্রায়শই অ-নির্দিষ্ট ব্যান্ডের প্রবণ হয় তবে অন্যান্য উত্স থেকে এনজাইমগুলি তা করে না। এনজাইমের অত্যধিক পরিমাণ কখনও কখনও অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনের দিকে পরিচালিত করতে পারে। পাল্টা ব্যবস্থার মধ্যে রয়েছে: প্রয়োজনে প্রাইমার পুনরায় ডিজাইন করুন। এনজাইমের পরিমাণ কমিয়ে দিন বা অন্য উৎস দিয়ে প্রতিস্থাপন করুন। প্রাইমারের পরিমাণ হ্রাস করুন, যথাযথভাবে টেমপ্লেটের পরিমাণ বাড়ান এবং চক্রের সংখ্যা হ্রাস করুন। অ্যানিলিং তাপমাত্রা যথাযথভাবে বাড়ান বা দুই-তাপমাত্রা পয়েন্ট পদ্ধতি ব্যবহার করুন (93 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ডিনাচুরেশন, অ্যানিলিং এবং 65 ডিগ্রি সেলসিয়াসের কাছাকাছি এক্সটেনশন)।

 

4. ফ্ল্যাকি ড্র্যাগ বা স্মিয়ার দেখা যায় পিসিআর অ্যামপ্লিফিকেশন কখনও কখনও দাগযুক্ত ব্যান্ড, শীটের মতো ব্যান্ড বা কার্পেটের মতো ব্যান্ড হিসাবে প্রদর্শিত হয়। কারণগুলি প্রায়শই অত্যধিক এনজাইম বা এনজাইমের নিম্নমানের, খুব বেশি dNTP ঘনত্ব, খুব বেশি Mg2+ ঘনত্ব, খুব কম অ্যানিলিং তাপমাত্রা এবং অনেকগুলি চক্র দ্বারা সৃষ্ট হয়। পাল্টা ব্যবস্থাগুলির মধ্যে রয়েছে: ① এনজাইমের পরিমাণ হ্রাস করুন, বা অন্য উৎসের সাথে এনজাইম প্রতিস্থাপন করুন। ②dNTP এর ঘনত্ব হ্রাস করুন। যথাযথভাবে Mg2+ ঘনত্ব কমিয়ে দিন। টেমপ্লেটের পরিমাণ বাড়ান এবং চক্রের সংখ্যা কমিয়ে দিন