ЧЗВ за PCR 1. Фалшиво отрицателен, не се появява амплификационна лента 2. Фалшиво положителен 3. Появяват се неспецифични амплификационни ленти 4. Появяват се люспести ленти за влачене или петна:

1 Фалшиво отрицателен, не се появява усилена лента. Ключовите аспекти на PCR реакцията са

① подготовка на шаблонна нуклеинова киселина

② грунд качество и специфичност

③ качество на ензима и

④ Условия на PCR цикъл. За да се намерят причините, трябва да се проведат анализи и изследвания на горните връзки.

шаблон:

① Шаблонът съдържа примесни протеини

② Шаблонът съдържа Taq ензимни инхибитори

③ Протеините в шаблона не се усвояват и отстраняват, особено хистоните в хромозомите

④ Изгубено е твърде много по време на извличането и подготовката на шаблона или е вдишан фенол

⑤Матричната нуклеинова киселина не е напълно денатурирана. Когато качеството на ензимите и праймерите е добро, ако не се появят амплификационни ленти, най-вероятно има нещо нередно с процеса на смилане на пробата или с процеса на извличане на шаблонна нуклеинова киселина. Следователно трябва да се подготви ефективен и стабилен разтвор за храносмилане и процедурата трябва да бъде фиксирана и не трябва да се променя по желание. . Инактивиране на ензима: Необходимо е да се замени новият ензим или да се използват стари и нови ензими едновременно, за да се анализира дали фалшивите отрицателни резултати са причинени от загуба или недостатъчна ензимна активност. Трябва да се отбележи, че понякога ензимът Taq се забравя. Праймери: Качеството на праймера, концентрацията на праймера и дали концентрациите на двата праймера са симетрични са често срещани причини за PCR неуспех или незадоволителни ивици на амплификация и лесна дифузия. Има проблеми с качеството на синтеза на праймера в някои партиди. Единият от двата праймера има висока концентрация, а другият има ниска концентрация, което води до нискоефективно асиметрично усилване.

Мерките за противодействие са:

① Изберете добра единица за синтез на грунд.

② Концентрацията на праймерите не трябва да разглежда само стойността на OD, но също така да обърне внимание на изходния разтвор на праймера за електрофореза в агарозен гел. Трябва да има праймерни ленти и яркостта на двете праймерни ленти трябва да е приблизително еднаква. Например, единият грунд има лента, а другият грунд няма лента. За ленти PCR може да се провали в този момент и трябва да бъде решен чрез преговори с единицата за синтез на праймер. Ако единият праймер има висока яркост, а другият има ниска яркост, балансирайте концентрациите при разреждане на праймерите.

③ Праймерите трябва да се съхраняват във висока концентрация и малки количества, за да се предотврати повторно замразяване и размразяване или дългосрочно съхранение в хладилник, което може да доведе до влошаване и разграждане на праймерите.

④Конструкцията на праймера е неразумна, като дължината на праймера не е достатъчна, образуват се димери между праймерите и т.н. Концентрация на Mg2+: Концентрацията на Mg2+ йони има голямо влияние върху ефективността на PCR амплификация. Ако концентрацията е твърде висока, тя може да намали специфичността на PCR амплификацията. Ако концентрацията е твърде ниска, това ще повлияе на добива на PCR амплификация и дори ще доведе до неуспех на PCR амплификацията без усилващи ленти. Промени в реакционния обем: Обикновено обемите, използвани за PCR амплификация, са 20 ul, 30 ul и 50 ul. Или 100 ul, какъв обем трябва да се използва за PCR амплификация се определя според различните цели на научни изследвания и клинични тестове. След като направите малък обем, например 20 ul, и след това направите по-голям обем, трябва да следвате условията, в противен случай лесно ще се провали. Физически причини: Денатурацията е много важна за PCR амплификацията. Ако температурата на денатурация е ниска и времето за денатурация е кратко, е много вероятно да се появят фалшиви отрицателни резултати; температурата на отгряване е твърде ниска, което може да причини неспецифично усилване и да намали ефективността на специфичното усилване. Температурата на отгряване е твърде висока. Повлиява силно свързването на праймерите към матриците и намалява ефективността на PCR амплификацията. Понякога е необходимо да се използва стандартен термометър за проверка на температурите на денатурация, отгряване и удължаване в усилвателя или водоразтворимия съд. Това също е една от причините за неуспех на PCR. Вариация на целевата последователност: Ако целевата последователност е мутирала или изтрита, което засяга специфичното свързване на праймера към шаблона, или праймерът и шаблонът губят комплементарната последователност поради делецията на определен сегмент от целевата последователност, PCR амплификацията няма да има успех.

2. фалшиво положителен Лентата на PCR амплификация, която се появява, съответства на лентата на целевата последователност и понякога лентата е по-подредена и по-ярка. Неподходящ дизайн на праймера: Избраната амплификационна последователност има хомоложност с нецелевата амплификационна последователност, така че при извършване на PCR амплификация амплифицираният PCR продукт е нецелева последователност. Ако целевата последователност е твърде къса или праймерът е твърде къс, лесно могат да възникнат фалшиви положителни резултати. Грундовете трябва да бъдат преработени. Кръстосано замърсяване на целеви последователности или продукти на амплификация: Има две причини за това замърсяване: Първо, кръстосано замърсяване на целия геном или големи фрагменти, което води до фалшиви положителни резултати. Този фалшив положителен резултат може да бъде решен чрез следните методи: Бъдете внимателни и нежни, когато работите, за да предотвратите засмукване на целевата последователност в пистолета за проби или изпръскване от центрофужната епруветка. С изключение на ензими и вещества, които не могат да издържат на високи температури, всички реактиви или оборудване трябва да се стерилизират под високо налягане. Всички центрофужни епруветки и накрайниците на пипетите за инжектиране на проби трябва да се използват веднъж. Ако е необходимо, реакционните епруветки и реагентите се облъчват с ултравиолетова светлина преди добавяне на пробата, за да се унищожат наличните нуклеинови киселини. Второто е замърсяването на малки фрагменти от нуклеинови киселини във въздуха. Тези малки фрагменти са по-къси от целевата последователност, но имат известна хомология. Те могат да бъдат сплайсирани един към друг и след като са комплементарни на праймерите, PCR продуктите могат да бъдат амплифицирани, което води до фалшиви положителни резултати, които могат да бъдат намалени или елиминирани чрез вложени PCR методи.

 

3. Появяват се неспецифични ивици на усилване Лентите, които се появяват след PCR амплификацията, не са в съответствие с очаквания размер, по-големи или по-малки, или се появяват едновременно специфични и неспецифични ивици на усилване. Причините за появата на неспецифични ивици са: първо, праймерите не са напълно комплементарни на целевата последователност или праймерите се агрегират, за да образуват димери. Втората причина е, че концентрацията на Mg2+ йони е твърде висока, температурата на отгряване е твърде ниска и броят на PCR циклите е твърде висок. Вторият фактор е качеството и количеството на ензима. Ензимите от някои източници често са предразположени към неспецифични ивици, но ензимите от други източници не. Прекомерните количества ензими понякога могат да доведат до неспецифично усилване. Контрамерките включват: редизайн на праймери, ако е необходимо. Намалете количеството ензим или го заменете с друг източник. Намалете количеството праймери, увеличете съответно количеството шаблон и намалете броя на циклите. Увеличете температурата на отгряване по подходящ начин или използвайте метода с две температурни точки (денатурация при 93°C, отгряване и удължаване около 65°C).

 

4. Появяват се люспести плъзгачи или петна. PCR амплификацията понякога се появява като размазани ленти, ленти като лист или ленти като килим. Причините често са причинени от твърде много ензим или лошо качество на ензима, твърде висока концентрация на dNTP, твърде висока концентрация на Mg2+, твърде ниска температура на отгряване и твърде много цикли. Контрамерките включват: ① Намалете количеството ензим или заменете ензима с друг източник. ②Намалете концентрацията на dNTP. Намалете по подходящ начин концентрацията на Mg2+. Увеличете броя на шаблоните и намалете броя на циклите