PCR Tez-tez verilən suallar 1. Yanlış mənfi, gücləndirmə zolağı görünmür 2. Yanlış pozitiv 3. Qeyri-spesifik gücləndirmə zolaqları görünür 4. Kəpənək sürüşmə zolaqları və ya ləkə zolaqları görünür:
1Yanlış mənfi, gücləndirilmiş zolaq görünmür PCR reaksiyasının əsas aspektləri bunlardır
① şablon nuklein turşusunun hazırlanması
② astarın keyfiyyəti və spesifikliyi
③ ferment keyfiyyəti və
④ PCR dövrü şərtləri. Səbəbləri tapmaq üçün yuxarıdakı linklərdə də təhlil və araşdırma aparılmalıdır.
Şablon:
① Şablonda çirk zülalları var
② Şablon Taq enzim inhibitorlarını ehtiva edir
③ Şablondakı zülallar, xüsusilə xromosomlardakı histonlar həzm olunmur və çıxarılmır.
④ Şablonun çıxarılması və hazırlanması zamanı çox şey itirilib və ya fenol tənəffüs edilib
⑤Şablon nuklein turşusu tam denatürasiya olunmur. Fermentlərin və primerlərin keyfiyyəti yaxşı olduqda, gücləndirmə zolaqları görünmürsə, çox güman ki, nümunənin həzm prosesində və ya şablon nuklein turşusunun çıxarılması prosesində səhv bir şey var. Buna görə də təsirli və sabit bir həzm məhlulu hazırlanmalı və prosedur sabitlənməlidir və öz istəyi ilə dəyişdirilməməlidir. . Fermentin inaktivasiyası: Yalançı neqativlərin fermentin itirilməsi və ya qeyri-kafi fəaliyyətindən qaynaqlandığını təhlil etmək üçün yeni fermentin dəyişdirilməsi və ya həm köhnə, həm də yeni fermentlərin eyni vaxtda istifadə edilməsi lazımdır. Qeyd etmək lazımdır ki, bəzən Taq fermenti unudulur. Primerlər: Primer keyfiyyəti, primer konsentrasiyası və iki primerin konsentrasiyalarının simmetrik olub-olmaması PCR uğursuzluğu və ya qeyri-qənaətbəxş gücləndirmə zolaqları və asan diffuziya üçün ümumi səbəblərdir. Bəzi partiyalarda primer sintezinin keyfiyyətində problemlər var. İki primerdən biri yüksək konsentrasiyaya, digəri isə aşağı konsentrasiyaya malikdir, nəticədə aşağı effektiv asimmetrik gücləndirmə olur.
Qarşı tədbirlər bunlardır:
① Yaxşı primer sintez vahidi seçin.
② Primerlərin konsentrasiyası təkcə OD dəyərinə baxmaqla kifayətlənməməlidir, həm də agaroz gel elektroforezi üçün primer ehtiyat məhluluna diqqət yetirməlidir. Astar bantları olmalıdır və iki astar zolağının parlaqlığı təxminən eyni olmalıdır. Məsələn, bir astarın bandı, digərinin isə bandı yoxdur. Zolaqlar üçün PCR bu anda uğursuz ola bilər və primer sintez bölməsi ilə danışıqlar yolu ilə həll edilməlidir. Bir primer yüksək parlaqlığa, digəri isə aşağı parlaqlığa malikdirsə, astarları seyreltərkən konsentrasiyaları tarazlayın.
③ Astarların təkrar dondurulması və əriməsinin və ya astarların xarab olmasına və deqradasiyasına səbəb ola biləcək soyuducuda uzun müddət saxlanmasının qarşısını almaq üçün yüksək konsentrasiyada və kiçik miqdarda saxlanmalıdır.
④Astar dizaynı əsassızdır, məsələn, primer uzunluğu kifayət deyil, primerlər arasında dimerlər əmələ gəlir və s. Mg2+ konsentrasiyası: Mg2+ ion konsentrasiyası PCR gücləndirilməsinin effektivliyinə böyük təsir göstərir. Konsentrasiya çox yüksək olarsa, bu, PCR gücləndirilməsinin spesifikliyini azalda bilər. Konsentrasiya çox aşağı olarsa, bu, PCR gücləndirmə məhsuldarlığına təsir edəcək və hətta zolaqları gücləndirmədən PCR gücləndirilməsinin uğursuz olmasına səbəb olacaq. Reaksiya həcmində dəyişikliklər: Adətən PCR gücləndirilməsi üçün istifadə olunan həcmlər 20ul, 30ul və 50ul-dur. Və ya 100ul, PCR gücləndirilməsi üçün hansı həcmdən istifadə edilməli, elmi tədqiqat və klinik sınaqların müxtəlif məqsədləri ilə müəyyən edilir. Kiçik bir həcm, məsələn, 20ul, sonra daha böyük bir həcm etdikdən sonra, şərtlərə əməl etməlisiniz, əks halda asanlıqla uğursuz olacaq. Fiziki səbəblər: PCR gücləndirilməsi üçün denaturasiya çox vacibdir. Denatürasiya temperaturu aşağı olarsa və denaturasiya müddəti qısa olarsa, yalançı neqativlərin baş vermə ehtimalı çox yüksəkdir; yumşalma temperaturu çox aşağıdır, bu da qeyri-spesifik gücləndirməyə səbəb ola bilər və xüsusi gücləndirmə səmərəliliyini azalda bilər. Yuyulma temperaturu çox yüksəkdir. Astarların şablonlara bağlanmasına yüksək dərəcədə təsir edir və PCR gücləndirilməsinin effektivliyini azaldır. Bəzən gücləndiricidə və ya suda həll olunan qazanda denaturasiya, yumşalma və uzatma temperaturlarını yoxlamaq üçün standart termometrdən istifadə etmək lazımdır. Bu da PCR uğursuzluğunun səbəblərindən biridir. Hədəf ardıcıllığının dəyişməsi: Hədəf ardıcıllığı mutasiya edilmiş və ya silinmişsə, bu, primerin şablona xüsusi bağlanmasına təsir edirsə və ya primer və şablon hədəf ardıcıllığın müəyyən seqmentinin silinməsi səbəbindən tamamlayıcı ardıcıllığı itirirsə, PCR gücləndirilməsi uğurlu olmayacaq.
2.false pozitiv Görünən PCR gücləndirmə zolağı hədəf ardıcıllıq zolağına uyğundur və bəzən bant daha nizamlı və parlaq olur. Qeyri-uyğun primer dizaynı: Seçilmiş gücləndirmə ardıcıllığı qeyri-məqsədli gücləndirmə ardıcıllığı ilə homologiyaya malikdir, buna görə də PCR gücləndirilməsini həyata keçirərkən gücləndirilmiş PCR məhsulu qeyri-hədəf ardıcıllıqdır. Hədəf ardıcıllığı çox qısadırsa və ya primer çox qısadırsa, yalançı pozitivlər asanlıqla baş verə bilər. Astarların yenidən dizayn edilməsi lazımdır. Hədəf ardıcıllıqlarının və ya gücləndirmə məhsullarının çarpaz çirklənməsi: Bu çirklənmənin iki səbəbi var: Birincisi, bütün genomun və ya böyük fraqmentlərin çarpaz çirklənməsi, yanlış müsbət nəticələrə gətirib çıxarır. Bu yanlış müsbət aşağıdakı üsullarla həll edilə bilər: Hədəf ardıcıllığının nümunə tapançasına sorulmasının və ya sentrifuqa borusundan sıçramasının qarşısını almaq üçün işləyərkən diqqətli və yumşaq olun. Yüksək temperatura tab gətirə bilməyən fermentlər və maddələr istisna olmaqla, bütün reagentlər və ya avadanlıqlar yüksək təzyiqlə sterilizasiya edilməlidir. Bütün sentrifuqa boruları və nümunə enjeksiyon pipetinin ucları bir dəfə istifadə edilməlidir. Lazım gələrsə, mövcud nuklein turşularını məhv etmək üçün nümunə əlavə edilməzdən əvvəl reaksiya boruları və reagentlər ultrabənövşəyi işıqla şüalanır. İkincisi, havada nuklein turşularının kiçik fraqmentlərinin çirklənməsidir. Bu kiçik fraqmentlər hədəf ardıcıllığından daha qısadır, lakin müəyyən homologiyaya malikdir. Onlar bir-birinə birləşdirilə bilər və primerlərə tamamlayıcı olduqdan sonra PCR məhsulları gücləndirilə bilər, nəticədə yalançı pozitivlər yarana bilər ki, bu da yuvalanmış PCR üsulları ilə azaldıla və ya aradan qaldırıla bilər.
3. Qeyri-spesifik gücləndirmə zolaqları görünür PCR gücləndirilməsindən sonra görünən zolaqlar gözlənilən ölçüyə uyğun gəlmir, daha böyük və ya daha kiçikdir və ya hər iki xüsusi gücləndirmə zolaqları və qeyri-spesifik gücləndirmə zolaqları eyni vaxtda görünür. Qeyri-spesifik zolaqların görünüşünün səbəbləri bunlardır: birincisi, primerlər hədəf ardıcıllığı tamamilə tamamlayıcı deyil və ya primerlər dimerlər yaratmaq üçün birləşirlər. İkinci səbəb Mg2+ ion konsentrasiyasının çox yüksək olması, yumşalma temperaturunun çox aşağı olması və PCR dövrlərinin sayının çox yüksək olmasıdır. İkinci amil fermentin keyfiyyət və kəmiyyətidir. Bəzi mənbələrdən olan fermentlər çox vaxt qeyri-spesifik zolaqlara meyllidirlər, lakin digər mənbələrdən olan fermentlər yoxdur. Həddindən artıq miqdarda fermentlər bəzən qeyri-spesifik gücləndirməyə səbəb ola bilər. Qarşı tədbirlərə aşağıdakılar daxildir: zəruri hallarda primerləri yenidən dizayn edin. Fermentin miqdarını azaldın və ya başqa bir mənbə ilə əvəz edin. Astarların miqdarını azaldın, şablonun miqdarını müvafiq olaraq artırın və dövrlərin sayını azaldın. Yuvlama temperaturunu müvafiq qaydada artırın və ya iki temperatur nöqtəsi metodundan istifadə edin (93°C-də denatürasiya, yumşalma və 65°C ətrafında uzanma).
4. Kəskin sürükləmə və ya ləkələr görünür PCR gücləndirilməsi bəzən ləkələnmiş lentlər, təbəqəşəkilli lentlər və ya xalçaya bənzər lentlər kimi görünür. Səbəblər çox vaxt çox ferment və ya keyfiyyətsiz ferment, çox yüksək dNTP konsentrasiyası, çox yüksək Mg2+ konsentrasiyası, çox aşağı tavlama temperaturu və çoxlu dövrlərdən qaynaqlanır. Qarşı tədbirlərə aşağıdakılar daxildir: ① Fermentin miqdarını azaldın və ya fermenti başqa mənbə ilə əvəz edin. ②dNTP konsentrasiyasını azaldın. Mg2+ konsentrasiyasını müvafiq olaraq azaldın. Şablonların sayını artırın və dövrlərin sayını azaldın
