يُستخدم فصل البروتينات وتنقيتها على نطاق واسع في أبحاث وتطبيقات الكيمياء الحيوية، وهي مهارة تشغيلية مهمة. يمكن أن تحتوي الخلية حقيقية النواة النموذجية على آلاف البروتينات المختلفة، بعضها غني جدًا والبعض الآخر يحتوي على نسخ قليلة فقط. من أجل دراسة معينةبروتينفمن الضروري أولاً تنقية البروتين من البروتينات الأخرى والجزيئات غير البروتينية.

1. طريقة التمليحبروتين:

الملح المحايد له تأثير كبير على ذوبان البروتين. بشكل عام، مع زيادة تركيز الملح تحت تركيز الملح المنخفض، تزداد قابلية ذوبان البروتين. وهذا ما يسمى التمليح. وعندما يستمر تركيز الملح في الزيادة، تنخفض ذائبية البروتين بدرجات متفاوتة وتنفصل الواحدة تلو الأخرى. وتسمى هذه الظاهرة التمليح.

2. طريقة تكديس النقاط الكهربية:

يكون التنافر الكهروستاتيكي بين الجزيئات هو الأصغر عندما يكون البروتين ثابتًا، وبالتالي تكون قابلية الذوبان هي الأصغر أيضًا. تختلف النقاط الكهربية للبروتينات المختلفة. يمكن استخدام الرقم الهيدروجيني لمحلول التكييف للوصول إلى النقطة الكهربية للبروتين وجعله يتراكم، ولكن نادرًا ما يتم استخدام هذه الطريقة بمفردها ويمكن دمجها مع طريقة التمليح.

3. غسيل الكلى والترشيح الفائق:

يستخدم غسيل الكلى غشاء شبه منفذ لفصل البروتينات ذات الأحجام الجزيئية المختلفة. تستخدم طريقة الترشيح الفائق الضغط العالي أو قوة الطرد المركزي لجعل الماء والجزيئات المذابة الصغيرة الأخرى تمر عبر غشاء شبه منفذ، بينمابروتينيبقى على الغشاء. يمكنك اختيار أحجام مسام مختلفة لاعتراض البروتينات ذات الأوزان الجزيئية المختلفة.

4. طريقة ترشيح الجل:

يُطلق عليها أيضًا كروماتوغرافيا استبعاد الحجم أو كروماتوغرافيا المنخل الجزيئي، وهي إحدى الطرق الأكثر فائدة لفصل مخاليط البروتين وفقًا للحجم الجزيئي. مواد التعبئة الأكثر استخدامًا في العمود هي جل الجلوكوز (Sephadex ged) وهلام الاغاروز (جل الاغاروز).

5. الرحلان الكهربائي:

تحت نفس حالة الرقم الهيدروجيني، يمكن فصل البروتينات المختلفة بسبب اختلاف أوزانها الجزيئية وشحناتها المختلفة في المجال الكهربائي. يجدر الانتباه إلى الرحلان الكهربائي المتساوي الجهد، والذي يستخدم الأمفوليت كحامل. أثناء الرحلان الكهربائي، يشكل الأمفوليت تدرجًا للأس الهيدروجيني يُضاف تدريجيًا من القطب الموجب إلى القطب السالب. عندما يسبح البروتين بشحنة معينة فيه، فإنه سيصل إلى بعضها البعض. موضع الرقم الهيدروجيني للنقطة الكهربائية متقطع، ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحليل وإعداد البروتينات المختلفة.

6. كروماتوغرافيا الاتصالات الأيونية:

تشمل عوامل الاتصال الأيونية عوامل الاتصال الكاتيونية (مثل كربوكسي ميثيل السليلوز، CM-سليلوز) وعوامل الاتصال الأنيونية (ثنائي إيثيل أمينو إيثيل السليلوز). عند المرور عبر عمود كروماتوغرافيا الاتصال الأيوني، يتم امتصاص البروتين ذو الشحنة المعاكسة لعامل الاتصال الأيوني على عامل الاتصال الأيوني، ومن ثم يتم امتصاصهبروتينيتم التخلص منه عن طريق تغيير الرقم الهيدروجيني أو القوة الأيونية.

7. اللوني التقارب:

يعد الفصل اللوني المتقارب طريقة مفيدة للغاية لفصل البروتينات. غالبًا ما يتطلب الأمر خطوة واحدة فقط لفصل بروتين معين ليتم تنقيته من خليط بروتين فوضوي عالي النقاء.

تعتمد هذه الطريقة على الارتباط النوعي وليس التساهمي لبروتينات معينة بجزيء آخر يسمى الليجند (Ligand).

المبدأ الأساسي:

توجد البروتينات في خليط فوضوي في الأنسجة أو الخلايا، ويحتوي كل نوع من الخلايا على آلاف البروتينات المختلفة. ولذلك فإن التمييز بين البروتينات جزء مهم من الكيمياء الحيوية، ولم يكن وحده. أو يمكن لمجموعة من الطرق الجاهزة إزالة أي نوع من البروتين من البروتين المختلط الفوضوي، لذلك غالبًا ما يتم استخدام عدة طرق معًا.