الأسئلة الشائعة حول PCR 1. سلبية كاذبة، لا يظهر نطاق تضخيم 2. إيجابية كاذبة 3. تظهر نطاقات تضخيم غير محددة 4. تظهر شرائط السحب أو شرائط اللطاخة:

1 سلبي كاذب، لا يظهر شريط مضخم. الجوانب الرئيسية لتفاعل PCR هي:

① إعداد قالب الحمض النووي

② جودة التمهيدي والخصوصية

③ جودة الانزيم و

④ ظروف دورة PCR. ولمعرفة الأسباب ينبغي أيضًا إجراء التحليل والبحث على الروابط المذكورة أعلاه.

نموذج:

① يحتوي القالب على بروتينات شوائب

② يحتوي القالب على مثبطات إنزيم طق

③ لا يتم هضم البروتينات الموجودة في القالب وإزالتها، وخاصة الهستونات الموجودة في الكروموسومات

④ فقد الكثير أثناء استخراج القالب وإعداده، أو تم استنشاق الفينول

⑤لم يتم تغيير طبيعة الحمض النووي للقالب بشكل كامل. عندما تكون جودة الإنزيمات والبادئات جيدة، وإذا لم تظهر نطاقات التضخيم، فمن المرجح أن يكون هناك خطأ ما في عملية هضم العينة أو عملية استخلاص الحمض النووي القالب. لذلك يجب تحضير محلول هضمي فعال ومستقر، ويجب تثبيت الإجراء وعدم تغييره حسب الرغبة. . تعطيل الإنزيم: من الضروري استبدال الإنزيم الجديد، أو استخدام الإنزيمات القديمة والجديدة في نفس الوقت لتحليل ما إذا كانت النتائج السلبية الكاذبة ناتجة عن فقدان أو عدم كفاية نشاط الإنزيم. تجدر الإشارة إلى أنه في بعض الأحيان يتم نسيان إنزيم طق. البادئات: جودة التمهيدي، وتركيز التمهيدي، وما إذا كانت تركيزات البادئين متناظرة هي الأسباب الشائعة لفشل PCR أو نطاقات التضخيم غير المرضية والانتشار السهل. هناك مشاكل في جودة تركيب التمهيدي في بعض الدفعات. يحتوي أحد البادئين على تركيز عالٍ والآخر يحتوي على تركيز منخفض، مما يؤدي إلى تضخيم غير متماثل منخفض الكفاءة.

التدابير المضادة هي:

① حدد وحدة تركيب تمهيدي جيدة.

② يجب ألا ينظر تركيز البادئات إلى قيمة OD فحسب، بل يجب أيضًا الانتباه إلى محلول المخزون التمهيدي للرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. يجب أن يكون هناك نطاقات تمهيدية، ويجب أن يكون سطوع النطاقين التمهيديين متماثلًا تقريبًا. على سبيل المثال، يحتوي أحد البادئين على شريط بينما لا يحتوي البادئ الآخر على شريط. بالنسبة للشرائط، قد يفشل تفاعل البوليميراز المتسلسل في هذا الوقت ويجب حله من خلال التفاوض مع وحدة تركيب التمهيدي. إذا كان أحد البادئات ذو سطوع عالٍ والآخر ذو سطوع منخفض، قم بموازنة التركيزات عند تخفيف البادئات.

③ يجب تخزين البادئات بتركيزات عالية وكميات صغيرة لمنع التجميد والذوبان المتكرر أو التخزين طويل الأمد في الثلاجة، مما قد يؤدي إلى تدهور وتدهور البادئات.

④التصميم التمهيدي غير معقول، مثل أن طول التمهيدي ليس كافيًا، وتتشكل الثنائيات بين البادئات، وما إلى ذلك. تركيز Mg2+: تركيز أيون Mg2+ له تأثير كبير على كفاءة تضخيم PCR. إذا كان التركيز مرتفعًا جدًا، فقد يقلل من خصوصية تضخيم PCR. إذا كان التركيز منخفضًا جدًا، فسوف يؤثر ذلك على عائد تضخيم PCR بل ويتسبب في فشل تضخيم PCR دون تضخيم النطاقات. التغيرات في حجم التفاعل: عادةً ما تكون الأحجام المستخدمة لتضخيم PCR هي 20ul و30ul و50ul. أو 100ul، يتم تحديد الحجم الذي يجب استخدامه لتضخيم PCR وفقًا للأغراض المختلفة للبحث العلمي والاختبارات السريرية. بعد عمل حجم صغير، مثل 20ul، ثم عمل حجم أكبر، يجب عليك اتباع الشروط، وإلا فسوف يفشل بسهولة. الأسباب المادية: يعد تمسخ الطبيعة مهمًا جدًا لتضخيم PCR. إذا كانت درجة حرارة تمسخه منخفضة وكان وقت تمسخه قصيرًا، فمن المحتمل جدًا أن تحدث نتائج سلبية كاذبة؛ درجة حرارة التلدين منخفضة جدًا، مما قد يسبب تضخيمًا غير محدد ويقلل من كفاءة التضخيم المحددة. درجة حرارة التلدين مرتفعة للغاية. يؤثر بشكل كبير على ربط الاشعال بالقوالب ويقلل من كفاءة تضخيم PCR. في بعض الأحيان يكون من الضروري استخدام مقياس حرارة قياسي للتحقق من درجات حرارة التسخين والتليين والتمديد في مكبر الصوت أو الوعاء القابل للذوبان في الماء. وهذا أيضًا أحد أسباب فشل PCR. اختلاف تسلسل الهدف: إذا تم تحور أو حذف تسلسل الهدف مما يؤثر على الارتباط المحدد للتمهيدي بالقالب، أو يفقد التمهيدي والقالب التسلسل التكميلي بسبب حذف جزء معين من تسلسل الهدف، يتم تضخيم PCR لن تكون ناجحة.

2. إيجابي كاذب: يتوافق نطاق تضخيم PCR الذي يظهر مع نطاق التسلسل المستهدف، وفي بعض الأحيان يكون النطاق أكثر تنظيمًا وأكثر سطوعًا. تصميم تمهيدي غير مناسب: تسلسل التضخيم المحدد له تماثل مع تسلسل التضخيم غير المستهدف، لذلك عند إجراء تضخيم PCR، يكون منتج PCR المضخم تسلسلًا غير مستهدف. إذا كان التسلسل المستهدف قصيرًا جدًا أو كان التمهيدي قصيرًا جدًا، فقد تحدث نتائج إيجابية كاذبة بسهولة. الاشعال تحتاج إلى إعادة تصميم. التلوث المتبادل للتسلسلات المستهدفة أو منتجات التضخيم: هناك سببان لهذا التلوث: أولاً، التلوث المتبادل للجينوم بأكمله أو الأجزاء الكبيرة، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة. يمكن حل هذه النتيجة الإيجابية الكاذبة بالطرق التالية: كن حذرًا ولطيفًا عند التشغيل لمنع امتصاص التسلسل المستهدف في مسدس العينة أو تناثره من أنبوب الطرد المركزي. باستثناء الإنزيمات والمواد التي لا تتحمل درجات الحرارة العالية، يجب تعقيم جميع الكواشف أو المعدات بالضغط العالي. ينبغي استخدام جميع أنابيب الطرد المركزي ونصائح ماصة حقن العينة مرة واحدة. إذا لزم الأمر، يتم تشعيع أنابيب التفاعل والكواشف بالأشعة فوق البنفسجية قبل إضافة العينة لتدمير الأحماض النووية الموجودة. والثاني هو تلوث شظايا صغيرة من الأحماض النووية في الهواء. هذه الأجزاء الصغيرة أقصر من التسلسل المستهدف، ولكن لها تماثل معين. يمكن ربطها ببعضها البعض، وبعد أن تكون مكملة للبادئات، يمكن تضخيم منتجات PCR، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة، والتي يمكن تقليلها أو إزالتها عن طريق طرق PCR المتداخلة.

 

3. تظهر نطاقات تضخيم غير محددة النطاقات التي تظهر بعد تضخيم PCR غير متوافقة مع الحجم المتوقع، سواء أكبر أو أصغر، أو تظهر نطاقات التضخيم المحددة ونطاقات التضخيم غير المحددة في نفس الوقت. أسباب ظهور نطاقات غير محددة هي: أولاً، البادئات ليست مكملة تمامًا للتسلسل المستهدف، أو تتجمع البادئات لتشكل dimers. السبب الثاني هو أن تركيز أيون Mg2+ مرتفع جدًا، ودرجة حرارة التلدين منخفضة جدًا، وعدد دورات PCR مرتفع جدًا. العامل الثاني هو نوعية وكمية الانزيم. غالبًا ما تكون الإنزيمات من بعض المصادر عرضة لنطاقات غير محددة ولكن الإنزيمات من مصادر أخرى لا تفعل ذلك. قد تؤدي الكميات المفرطة من الإنزيمات في بعض الأحيان إلى تضخيم غير محدد. وتشمل التدابير المضادة ما يلي: إعادة تصميم البادئات إذا لزم الأمر. تقليل كمية الإنزيم أو استبداله بمصدر آخر. تقليل كمية الاشعال، وزيادة كمية القالب بشكل مناسب، وتقليل عدد الدورات. قم بزيادة درجة حرارة التلدين بشكل مناسب أو استخدم طريقة نقطتي درجة الحرارة (تمسخ الطبيعة عند 93 درجة مئوية، التلدين والتمديد حوالي 65 درجة مئوية).

 

4. ظهور سحب أو مسحات متقشرة. يظهر تضخيم PCR أحيانًا على شكل أشرطة ملطخة أو أشرطة تشبه الصفائح أو أشرطة تشبه السجاد. غالبًا ما تكون الأسباب ناتجة عن وجود كمية كبيرة جدًا من الإنزيم أو ضعف جودة الإنزيم، وتركيز dNTP مرتفع جدًا، وتركيز Mg2+ مرتفع جدًا، ودرجة حرارة التلدين منخفضة جدًا، والعديد من الدورات. تشمل الإجراءات المضادة ما يلي: ① تقليل كمية الإنزيم، أو استبدال الإنزيم بمصدر آخر. ②تقليل تركيز dNTP. قم بتقليل تركيز Mg2+ بشكل مناسب. زيادة كمية القوالب وتقليل عدد الدورات