PCR FAQ 1. የውሸት ኔጌቲቭ፣ ምንም የማጉላት ባንድ አይታይም 2. የውሸት ፖዘቲቭ 3. ልዩ ያልሆኑ የማጉላት ባንዶች ይታያሉ 4. ጠፍጣፋ ድራግ ስትሪፕ ወይም ስሚር ስትሪፕ ይታያል።

1ውሸት አሉታዊ፣ ምንም የተጨመረ ባንድ አይታይም የ PCR ምላሽ ቁልፍ ገጽታዎች ናቸው።

① አብነት ኑክሊክ አሲድ ማዘጋጀት

② የፕሪመር ጥራት እና ልዩነት

③ የኢንዛይም ጥራት እና

④ PCR ዑደት ሁኔታዎች. ምክንያቶቹን ለማግኘት, ከላይ በተጠቀሱት ማገናኛዎች ላይ ትንተና እና ምርምር መደረግ አለበት.

አብነት፡

① አብነቱ ርኩስ የሆኑ ፕሮቲኖችን ይዟል

② አብነቱ Taq ኢንዛይም አጋቾችን ይዟል

③ በአብነት ውስጥ ያሉት ፕሮቲኖች አልተፈጩም እና አልተወገዱም፣ በተለይም በክሮሞሶም ውስጥ ያሉ ሂስቶን

④ አብነት በሚወጣበት እና በሚዘጋጅበት ጊዜ በጣም ብዙ ጠፍቷል፣ ወይም ፌኖል ወደ ውስጥ ገባ

⑤አብነት ኑክሊክ አሲድ ሙሉ በሙሉ አልተወገደም። የኢንዛይሞች እና የፕሪመርስ ጥራት ጥሩ በሚሆንበት ጊዜ የማጉላት ባንዶች የማይታዩ ከሆነ በናሙናው የምግብ መፈጨት ሂደት ወይም አብነት ኑክሊክ አሲድ የማውጣት ሂደት ላይ የሆነ ችግር ሊኖር ይችላል። ስለዚህ, ውጤታማ እና የተረጋጋ የምግብ መፍጨት መፍትሄ መዘጋጀት አለበት, እና አሰራሩ መስተካከል አለበት እና በፍላጎት መቀየር የለበትም. . ኢንዛይም አለማግበር፡- አዲሱን ኢንዛይም መተካት ወይም ሁለቱንም አሮጌ እና አዲስ ኢንዛይሞችን በተመሳሳይ ጊዜ በመጠቀም የውሸት አሉታዊ ነገሮች በመጥፋት ወይም በቂ ያልሆነ የኢንዛይም እንቅስቃሴ መከሰታቸውን ለመተንተን ያስፈልጋል። አንዳንድ ጊዜ የታክ ኢንዛይም እንደሚረሳ ልብ ሊባል የሚገባው ነው.Primers: Primer quality, primer focus, እና የሁለቱ ፕሪመር ውህዶች የተመጣጠነ መሆን አለመሆኑን ለ PCR ውድቀት ወይም አጥጋቢ ያልሆነ ማጉያ ባንዶች እና ቀላል ስርጭት የተለመዱ ምክንያቶች ናቸው. በአንዳንድ ስብስቦች ውስጥ የፕሪመር ውህደት ጥራት ላይ ችግሮች አሉ. ከሁለቱ ፕሪመርሮች አንዱ ከፍተኛ ትኩረትን እና ሌላኛው ዝቅተኛ ትኩረትን ያመጣል, በዚህም ምክንያት ዝቅተኛ ቅልጥፍና ያለው asymmetric amplification.

የመከላከያ እርምጃዎች የሚከተሉት ናቸው

① ጥሩ የፕሪመር ውህደት ክፍል ይምረጡ።

② የፕሪሚየር ማጎሪያው የኦዲ እሴትን ብቻ ሳይሆን ለአጋሮዝ ጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ ለፕሪመር ክምችት መፍትሄ ትኩረት መስጠት አለበት. የፕሪመር ባንዶች መኖር አለባቸው፣ እና የሁለቱ የፕሪመር ባንዶች ብሩህነት በግምት ተመሳሳይ መሆን አለበት። ለምሳሌ አንድ ፕሪመር ባንድ ሲኖረው ሌላኛው ፕሪመር ባንድ የለውም። ለጭረቶች፣ PCR በዚህ ጊዜ ሊወድቅ ይችላል እና ከፕሪመር ውህድ ክፍል ጋር በመደራደር መፍታት አለበት። አንድ ፕሪመር ከፍተኛ ብሩህነት ያለው እና ሌላኛው ዝቅተኛ ብሩህነት ካለው, ፕሪሚኖችን በሚቀልጥበት ጊዜ ትኩረቱን ማመጣጠን.

③ ፕሪመርሮች ተደጋጋሚ ቅዝቃዜን እና መቅለጥን ወይም በማቀዝቀዣው ውስጥ ለረጅም ጊዜ እንዳይከማቹ ለመከላከል በከፍተኛ መጠን እና በትንሽ መጠን መቀመጥ አለባቸው ይህም የፕሪሚየር መበላሸት እና መበላሸት ሊያስከትል ይችላል.

④ የፕሪመር ዲዛይኑ ምክንያታዊነት የጎደለው ነው, ለምሳሌ የፕሪሚየር ርዝማኔ በቂ አይደለም, ዲመሮች በፕሪሚየር መካከል ይፈጠራሉ, ወዘተ Mg2+ ማጎሪያ: Mg2+ ion ማጎሪያ በ PCR ማጉላት ውጤታማነት ላይ ትልቅ ተጽእኖ አለው. ትኩረቱ በጣም ከፍ ያለ ከሆነ, የ PCR ማጉላትን ልዩነት ሊቀንስ ይችላል. ትኩረቱ በጣም ዝቅተኛ ከሆነ የ PCR ማጉላት ምርት ላይ ተጽእኖ ያሳድራል አልፎ ተርፎም ፒሲአር ማጉላት ያለ ማጉላት ባንዶች እንዲሳካ ያደርጋል። የምላሽ መጠን ለውጦች፡ ብዙ ጊዜ ለ PCR ማጉላት የሚያገለግሉት ጥራዞች 20ul፣ 30ul እና 50ul ናቸው። ወይም 100ul፣ ለ PCR ማጉላት ምን ዓይነት መጠን ጥቅም ላይ መዋል እንዳለበት የተዘጋጀው በተለያዩ የሳይንሳዊ ምርምር እና ክሊኒካዊ ሙከራዎች ዓላማዎች መሠረት ነው። እንደ 20ul ያሉ አነስተኛ መጠን ካደረጉ በኋላ እና ከዚያም ትልቅ መጠን ካደረጉ በኋላ ሁኔታዎችን መከተል አለብዎት, አለበለዚያ በቀላሉ አይሳካም. አካላዊ ምክንያቶች፡- Denaturation ለ PCR ማጉላት በጣም አስፈላጊ ነው። የ denaturation ሙቀት ዝቅተኛ ከሆነ እና denaturation ጊዜ አጭር ከሆነ, የውሸት አሉታዊ በጣም አይቀርም ናቸው; የማጥቂያው ሙቀት በጣም ዝቅተኛ ነው, ይህም ልዩ ያልሆነ ማጉላትን ሊያስከትል እና የተወሰነውን የማጉላት ቅልጥፍናን ሊቀንስ ይችላል. የመረበሽ ሙቀት በጣም ከፍተኛ ነው። የፕሪመርሮችን ከአብነት ጋር በማያያዝ ላይ ከፍተኛ ተጽዕኖ ያሳድራል እና PCR የማጉላት ቅልጥፍናን ይቀንሳል። አንዳንድ ጊዜ በድምጽ ማጉያው ወይም በውሃ ውስጥ በሚሟሟ ድስት ውስጥ ያለውን የዴንች, የመደንዘዝ እና የኤክስቴንሽን ሙቀትን ለመፈተሽ መደበኛ ቴርሞሜትር መጠቀም አስፈላጊ ነው. ይህ ደግሞ ለ PCR ውድቀት ምክንያቶች አንዱ ነው. የዒላማ ቅደም ተከተል ልዩነት፡ የዒላማው ቅደም ተከተል ከተቀየረ ወይም ከተሰረዘ፣ ይህም የፕሪመርን ልዩ የአብነት ትስስር የሚነካ ከሆነ፣ ወይም ፕሪመር እና አብነት የታለመው ተከታታይ የተወሰነ ክፍል በመሰረዙ ምክንያት ተጨማሪውን ቅደም ተከተል ያጣሉ ፣ PCR ማጉላት ስኬታማ አይሆንም.

2.false positive የሚታየው PCR ማጉያ ባንድ ከዒላማው ተከታታይ ባንድ ጋር የሚጣጣም ሲሆን አንዳንድ ጊዜ ባንዱ ይበልጥ ሥርዓታማ እና ብሩህ ይሆናል። ተገቢ ያልሆነ የፕሪመር ንድፍ፡ የተመረጠው የማጉላት ቅደም ተከተል ኢላማ ካልሆነው የማጉላት ቅደም ተከተል ጋር ግብረ-ሰዶማዊነት አለው፣ ስለዚህ PCR ማጉላት ሲሰራ፣ የተጨመረው PCR ምርት ኢላማ ያልሆነ ቅደም ተከተል ነው። የዒላማው ቅደም ተከተል በጣም አጭር ከሆነ ወይም ፕሪመር በጣም አጭር ከሆነ, የተሳሳቱ አዎንታዊ ውጤቶች በቀላሉ ሊከሰቱ ይችላሉ. ፕሪመርስ እንደገና መንደፍ ያስፈልጋል። የዒላማ ቅደም ተከተሎችን ወይም የማጉላት ምርቶችን መበከል፡ ለዚህ ብክለት ሁለት ምክንያቶች አሉ፡ አንደኛ፡ አጠቃላይ ጂኖም ወይም ትላልቅ ቁርጥራጮች መበከል ወደ ሐሰት አወንታዊ ውጤቶች ያመራል። ይህ የውሸት አወንታዊ ውጤት በሚከተሉት ዘዴዎች ሊፈታ ይችላል፡- የዒላማው ቅደም ተከተል ወደ ናሙና ሽጉጥ እንዳይጠባ ወይም ከሴንትሪፉጅ ቱቦ ውስጥ እንዳይረጭ ለመከላከል በሚሰሩበት ጊዜ ጥንቃቄ እና ገር ይሁኑ። ከፍተኛ ሙቀትን መቋቋም የማይችሉ ኢንዛይሞች እና ንጥረ ነገሮች ካልሆነ በስተቀር ሁሉም ሬጀንቶች ወይም መሳሪያዎች በከፍተኛ ግፊት ማምከን አለባቸው። ሁሉም ሴንትሪፉጅ ቱቦዎች እና ናሙና መርፌ pipette ምክሮች አንድ ጊዜ ጥቅም ላይ መዋል አለባቸው. አስፈላጊ ከሆነ, የኒውክሊክ አሲዶችን ለማጥፋት ናሙናውን ከመጨመራቸው በፊት የምላሽ ቱቦዎች እና ሬጀንቶች በአልትራቫዮሌት ብርሃን ይለቀቃሉ. ሁለተኛው በአየር ውስጥ ትናንሽ የኒውክሊክ አሲዶች መበከል ነው. እነዚህ ትናንሽ ቁርጥራጮች ከዒላማው ቅደም ተከተል አጠር ያሉ ናቸው, ነገር ግን የተወሰነ ግብረ-ሰዶማዊነት አላቸው. እርስ በእርሳቸው ሊከፋፈሉ ይችላሉ, እና ከፕሪምተሮች ጋር ከተሟሉ በኋላ, የ PCR ምርቶች ሊጨመሩ ይችላሉ, በዚህም ምክንያት የውሸት አወንታዊ ውጤቶችን ያስገኛሉ, ይህም በጎጆው PCR ዘዴዎች ሊቀንስ ወይም ሊጠፋ ይችላል.

 

3.Non-specific amplification bands ከ PCR ማጉላት በኋላ የሚታዩት ባንዶች ከሚጠበቀው መጠን፣ ትልቅም ሆነ ትንሽ፣ ወይም ሁለቱም የተወሰኑ የማጉላት ባንዶች እና ልዩ ያልሆኑ የማጉላት ባንዶች በተመሳሳይ ጊዜ ይታያሉ። ልዩ ያልሆኑ ባንዶች እንዲታዩ የሚያደርጉ ምክንያቶች፡- በመጀመሪያ፣ ፕሪመርዎቹ ከዒላማው ቅደም ተከተል ጋር ሙሉ በሙሉ አይሟሉም ወይም ፕሪመርዎቹ ድምርን ወደ ዳይመር ይፈጥራሉ። ሁለተኛው ምክንያት የ Mg2+ ion ትኩረት በጣም ከፍተኛ ነው, የአናኒንግ ሙቀት በጣም ዝቅተኛ ነው, እና የ PCR ዑደቶች ብዛት በጣም ከፍተኛ ነው. ሁለተኛው ምክንያት የኢንዛይም ጥራት እና መጠን ነው. ከአንዳንድ ምንጮች የሚመጡ ኢንዛይሞች ብዙውን ጊዜ ለየት ያሉ ላልሆኑ ባንዶች የተጋለጡ ናቸው ነገር ግን ከሌሎች ምንጮች የሚመጡ ኢንዛይሞች አያደርጉም. ከመጠን በላይ የሆኑ ኢንዛይሞች አንዳንድ ጊዜ ልዩ ያልሆነ ማጉላትን ሊያስከትል ይችላል. የመከላከያ እርምጃዎች የሚከተሉትን ያካትታሉ: አስፈላጊ ከሆነ ፕሪሚኖችን እንደገና ይንደፉ. የኢንዛይም መጠን ይቀንሱ ወይም በሌላ ምንጭ ይተኩ. የፕሪሚኖችን መጠን ይቀንሱ, የአብነት መጠን በትክክል ይጨምሩ እና የዑደቶችን ብዛት ይቀንሱ. የማስወገጃውን የሙቀት መጠን በትክክል ይጨምሩ ወይም የሁለት-ሙቀት ነጥብ ዘዴን ይጠቀሙ (በ 93 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ላይ ያለው የዴንች መጨናነቅ እና በ 65 ዲግሪ ሴንቲግሬድ አካባቢ ማራዘም)።

 

4.Flaky ጎትት ወይም ስሚር PCR ማጉላት አንዳንድ ጊዜ ስሚared ባንዶች ሆኖ ይታያል, አንሶላ-እንደ ባንዶች ወይም ምንጣፍ-እንደ ባንዶች. ምክንያቶቹ ብዙውን ጊዜ የሚከሰቱት በጣም ብዙ ኢንዛይም ወይም ጥራት የሌለው የኢንዛይም ጥራት፣ በጣም ከፍተኛ የዲኤንቲፒ ትኩረት፣ በጣም ከፍተኛ Mg2+ ትኩረት፣ በጣም ዝቅተኛ የማደንዘዣ ሙቀት እና በጣም ብዙ ዑደቶች ናቸው። የመከላከያ እርምጃዎች የሚከተሉትን ያካትታሉ፡- ① የኢንዛይም መጠን ይቀንሱ ወይም ኢንዛይሙን በሌላ ምንጭ ይተኩ። ②የዲኤንቲፒ ትኩረትን ይቀንሱ። የMg2+ ትኩረትን በአግባቡ ይቀንሱ። የአብነቶችን መጠን ይጨምሩ እና የዑደቶችን ብዛት ይቀንሱ