PCR Gereelde Vrae 1. Vals negatief, geen amplifikasieband verskyn nie 2. Vals positief 3. Nie-spesifieke amplifikasiebande verskyn 4. Afskilferige sleepstroke of smeerstroke verskyn:
1Vals negatief, geen versterkte band verskyn nie. Die sleutelaspekte van die PCR-reaksie is
① voorbereiding van templaat nukleïensuur
② primer kwaliteit en spesifisiteit
③ ensiem kwaliteit en
④ PCR-siklustoestande. Om die redes te vind, moet ontleding en navorsing ook op die bogenoemde skakels gedoen word.
Sjabloon:
① Die sjabloon bevat onreinheidproteïene
② Die sjabloon bevat Taq-ensiem-inhibeerders
③ Die proteïene in die sjabloon word nie verteer en verwyder nie, veral die histone in chromosome
④ Te veel het verlore gegaan tydens die onttrekking en voorbereiding van die sjabloon, of fenol is ingeasem
⑤Die sjabloonnukleïensuur is nie heeltemal gedenatureer nie. Wanneer die kwaliteit van ensieme en primers goed is, as amplifikasiebande nie verskyn nie, is dit heel waarskynlik dat daar iets fout is met die verteringproses van die monster of die templaatnukleïensuur-ekstraksieproses. Daarom moet 'n effektiewe en stabiele spysverteringoplossing voorberei word, en die prosedure moet vasgestel word en moet nie na willekeur verander word nie. . Ensiem inaktivering: Dit is nodig om die nuwe ensiem te vervang, of beide ou en nuwe ensieme op dieselfde tyd te gebruik om te ontleed of vals negatiewe veroorsaak word deur verlies of onvoldoende ensiemaktiwiteit. Daar moet kennis geneem word dat die Taq-ensiem soms vergeet word. Primers: Primerkwaliteit, primerkonsentrasie, en of die konsentrasies van die twee primers simmetries is, is algemene redes vir PCR-mislukking of onbevredigende amplifikasiebande en maklike diffusie. Daar is probleme met die kwaliteit van onderlaagsintese in sommige groepe. Een van die twee primers het 'n hoë konsentrasie en die ander het 'n lae konsentrasie, wat lei tot lae-doeltreffendheid asimmetriese amplifikasie.
Die teenmaatreëls is:
① Kies 'n goeie onderlaagsintese-eenheid.
② Die konsentrasie van primers moet nie net na die OD waarde kyk nie, maar ook aandag gee aan die primer voorraadoplossing vir agarose gel elektroforese. Daar moet onderlaagbande wees, en die helderheid van die twee onderlaagbande moet min of meer dieselfde wees. Byvoorbeeld, een onderlaag het 'n band en die ander onderlaag het geen band nie. Vir stroke kan PCR op hierdie tydstip misluk en moet dit opgelos word deur onderhandeling met die primer sintese-eenheid. As een onderlaag hoë helderheid het en die ander lae helderheid, balanseer die konsentrasies wanneer die onderlaag verdun word.
③ Primers moet in hoë konsentrasies en klein hoeveelhede gestoor word om herhaalde vries en ontdooiing of langtermynberging in die yskas te voorkom, wat kan lei tot agteruitgang en agteruitgang van die primers.
④Die primer ontwerp is onredelik, soos die primer lengte is nie genoeg nie, dimere word gevorm tussen primers, ens. Mg2+ konsentrasie: Mg2+ ioonkonsentrasie het 'n groot invloed op PCR amplifikasie doeltreffendheid. As die konsentrasie te hoog is, kan dit die spesifisiteit van PCR-amplifikasie verminder. As die konsentrasie te laag is, sal dit die PCR-amplifikasie-opbrengs beïnvloed en selfs veroorsaak dat die PCR-amplifikasie misluk sonder om bande te versterk. Veranderinge in reaksievolume: Gewoonlik is die volumes wat vir PCR-amplifikasie gebruik word 20ul, 30ul en 50ul. Of 100ul, watter volume moet gebruik word vir PCR-versterking word gestel volgens verskillende doeleindes van wetenskaplike navorsing en kliniese toetsing. Nadat u 'n klein volume gemaak het, soos 20ul, en dan 'n groter volume gemaak het, moet u die voorwaardes volg, anders sal dit maklik misluk. Fisiese redes: Denaturering is baie belangrik vir PCR-amplifikasie. As die denatureringstemperatuur laag is en die denatureringstyd kort is, sal vals negatiewes heel waarskynlik voorkom; die uitgloeitemperatuur is te laag, wat nie-spesifieke amplifikasie kan veroorsaak en die spesifieke versterkingsdoeltreffendheid kan verminder. Die uitgloeitemperatuur is te hoog. Beïnvloed die binding van primers aan sjablone hoogs en verminder PCR amplifikasie doeltreffendheid. Soms is dit nodig om 'n standaard termometer te gebruik om die denaturasie-, uitgloei- en verlengingstemperature in die versterker of wateroplosbare pot na te gaan. Dit is ook een van die redes vir PCR-mislukking. Teikenvolgorde-variasie: As die teikenvolgorde gemuteer of geskrap word, wat die spesifieke binding van die primer aan die sjabloon beïnvloed, of die primer en sjabloon verloor die komplementêre volgorde as gevolg van die verwydering van 'n sekere segment van die teikenvolgorde, die PCR-amplifikasie sal nie suksesvol wees nie.
2.vals positief Die PCR-amplifikasieband wat verskyn stem ooreen met die teikenvolgordeband, en soms is die band meer ordelik en helderder. Onvanpaste primer ontwerp: Die geselekteerde amplifikasie volgorde het homologie met die nie-teiken amplifikasie volgorde, dus wanneer PCR amplifikasie uitgevoer word, is die geamplifiseerde PCR produk 'n nie-teiken volgorde. As die teikenvolgorde te kort is of die primer te kort is, kan vals positiewes maklik voorkom. Primers moet herontwerp word. Kruiskontaminasie van teikenvolgordes of amplifikasieprodukte: Daar is twee redes vir hierdie kontaminasie: Eerstens, kruiskontaminasie van die hele genoom of groot fragmente, wat tot vals positiewes lei. Hierdie vals positiewe kan deur die volgende metodes opgelos word: Wees versigtig en sagkens wanneer jy werk om te verhoed dat die teikenvolgorde in die monsterpistool ingesuig of uit die sentrifugebuis gespat word. Behalwe vir ensieme en stowwe wat nie hoë temperature kan weerstaan nie, moet alle reagense of toerusting deur hoë druk gesteriliseer word. Alle sentrifugeerbuise en monster-inspuitpipetpunte moet een keer gebruik word. Indien nodig, word die reaksiebuise en reagense met ultravioletlig bestraal voordat die monster bygevoeg word om die teenwoordige nukleïensure te vernietig. Die tweede is die kontaminasie van klein fragmente nukleïensure in die lug. Hierdie klein fragmente is korter as die teikenvolgorde, maar het sekere homologie. Hulle kan aan mekaar gesplits word, en nadat dit aanvullend tot die primers is, kan die PCR-produkte geamplifiseer word, wat lei tot vals positiewes, wat deur geneste PKR-metodes verminder of uitgeskakel kan word.
3. Nie-spesifieke amplifikasiebande verskyn Die bande wat na PCR-amplifikasie verskyn, stem nie ooreen met die verwagte grootte nie, hetsy groter of kleiner, of beide spesifieke amplifikasiebande en nie-spesifieke amplifikasiebande verskyn op dieselfde tyd. Die redes vir die voorkoms van nie-spesifieke bande is: eerstens is die primers nie heeltemal komplementêr tot die teikenvolgorde nie, of die primers aggreger om dimere te vorm. Die tweede rede is dat die Mg2+ ioonkonsentrasie te hoog is, die uitgloeitemperatuur te laag is en die aantal PKR-siklusse te hoog is. Die tweede faktor is die kwaliteit en kwantiteit van die ensiem. Ensieme van sommige bronne is dikwels geneig tot nie-spesifieke bande, maar ensieme van ander bronne nie. Oormatige hoeveelhede ensieme kan soms lei tot nie-spesifieke amplifikasie. Die teenmaatreëls sluit in: herontwerp onderlaag indien nodig. Verminder die hoeveelheid ensiem of vervang dit met 'n ander bron. Verminder die hoeveelheid primers, verhoog die hoeveelheid sjabloon gepas en verminder die aantal siklusse. Verhoog die uitgloeitemperatuur gepas of gebruik die twee-temperatuurpuntmetode (denaturering by 93°C, uitgloeiing en verlenging rondom 65°C).
4. Vlokkige drag of smere verskyn PCR-versterking verskyn soms as gesmeerde bande, velagtige bande of matagtige bande. Die redes word dikwels veroorsaak deur te veel ensiem of swak kwaliteit van ensiem, te hoë dNTP konsentrasie, te hoë Mg2+ konsentrasie, te lae uitgloei temperatuur en te veel siklusse. Die teenmaatreëls sluit in: ① Verminder die hoeveelheid ensiem, of vervang die ensiem met 'n ander bron. ②Verminder die konsentrasie van dNTP. Verminder die Mg2+ konsentrasie gepas. Verhoog die hoeveelheid sjablone en verminder die aantal siklusse
